细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）由多种蛋白质、脂质、代谢物和核酸组成，由于可以全身传递生物信息，促进肿瘤及周边细胞间信号传递，被认为是临床诊断、治疗和预后的生物标志物[1]。 

尿液是一种有价值的诊断介质，在临床应用中已经成为仅次于血液的第二种最常用于临床诊断的体液类型。尿细胞外囊泡（urinary Extracellular Vesicles, uEVs），被认为是一种动态的生物活性液体，提升uEVs研究的标准化和可重复性，可反映肾脏，尿路上皮和前列腺组织中的分子过程以及生理和病理状况。

 

circRNA作为一种环状分子，因其具有共价闭环结构，赋予其核酸外切酶抗性和比线性RNA更高的稳定性。因此，circRNA很容易在人体循环液中被发现（特别是在癌症患者中），并被提议作为有效的生物标志物[2]。lncRNAs是人类转录组中最普遍的家族，可以发挥多种功能，如表观遗传调控、染色质重塑和翻译多肽等，是控制细胞/组织稳态以及包括癌症在内的各种疾病机制的重要组成部分。进一步解析uEVs-lnc/circRNAs的结构和功能，可为后续临床治疗相关癌症提供参考价值。 

2022年5月9日，索邦大学居里研究所Antonin Morillon教授在Journal of Extracellular Vesicles发表文章Urinary extracellular vesicles contain mature transcriptome enriched in circular and long noncoding RNAs with functional significance in prostate cancer。研究结果表明：uEVs含有简化的转录组和无内含子的细胞质转录本，以及丰富的lnc/circRNAs。并且，uEVs中的部分circRNAs和lncRNAs可在细胞间发挥信号转导功能，其中部分lncRNA亦具备很高的翻译潜力。本研究针对uEVs和体外细胞系EVs中的lnc/circRNAs进行双重分析并解析机制，为未来根据uEVs中lnc/circRNAs的表型鉴定前列腺癌症提供了诊断靶点。 

 

首先，作者从福尔马林浸泡的前列腺肿瘤和uEVs（来自前列腺患者）中提取总RNA进行差异表达分析发现，与肿瘤相比，uEVs在尿液中携带各种类型的RNAs，并且亚群非常丰富。在非编码 RNA中，lncRNA和circRNA的两个亚家族在uEVs中表现出差异富集。

图1 lncRNA及circRNA在肿瘤和uEVs中的差异表达

为了进一步检测uEVs中RNA种类及含量，作者对三种样本（冰冻肿瘤组织、福尔马林浸泡肿瘤组织、uEVs）的基因结构进行测序分析（针对外显子、内含子、3′-UTR、5′-UTR、启动子和基因间区域），发现uEVs的内含子和启动子极低（低于1%）。尽管使用RNA-seq协同测序，发现与冰冻和福尔马林肿瘤相比，uEVs中的内含子计数也仅占2.6%。并且，分析外显子和内含子的密度分布后，发现uEV的外显子覆盖率高于肿瘤，而内含子覆盖率低于肿瘤。此外，uEVs仅包含成熟的mRNA和lncRNA，并且大多均来自细胞质，极少来自细胞核。 

图2 uEVs中成熟的RNA大多来自细胞质

 

EVs富含的RNA在细胞间通信中起着关键作用，但是以往研究细胞间信号转导大多专注于miRNA上，而对circRNA和lncRNA知之甚少。为了探索uEVs中lnc/circRNAs在细胞间发挥的作用，作者对PC3、DU145和LNCaP（三种人的前列腺癌细胞系）以及cEVs（细胞培养基收集的EVs）先进行了总RNA提取，然后针对circRNA测序，发现60%的细胞和95%的cEVs-circRNA与前列腺癌细胞系存在交互。其中包含典型的雄激素应答RNA—circ-SMARCA5（具有致癌作用，在肿瘤和囊泡之间介导信号传导）。这提示，大多数uEVs的circRNAs可能来自前列腺细胞系，在细胞间亦可介导信号转导。针对lncRNA，作者为了确定哪些uEVs的lncRNA可以在宿主细胞中发挥作用，将三种组织（uEVs、PCa和cEVs）中的lncRNA与492个CLC2数据库（含介导癌症的lncRNA）的lncRNA相交，发现uEVs中富集了28个CLC2-lncRNA；其中含有PCAT6（前列腺癌转录本，可发挥miRNA分子海绵功能），而巧合的是在PCa细胞系及其EVs中均被富集。综上提示，uEVs中的circRNA和lncRNA均具有在细胞间发挥信号转导的潜力。 

图3 circRNA和lncRNA表达富集状况

 

那么EVs中富集的lncRNA是否具有翻译功能？作者也进行了相关研究。首先，为了研究uEV中的lncRNA的编码潜力（聚焦在新抗原特性上，并将肿瘤组织作为对照），作者过滤掉所有来自Gencode V32的注释蛋白质编码基因或假基因重叠的lncRNA转录本（避免与现有ORF或蛋白质的干扰），分别在肿瘤和uEVs中筛选出lncRNA。然后，在阅读框中鉴定潜在编码序列，针对每个RNA-seq文件中seq2HLA计算的MHC（主要组织相容性复合体）分型，使用NetMHCpan-4预测新抗原，结果发现二者大多数lncRNA可衍生出9-mer肽（识别新抗原的黄金标准）。这一结果表明，EVs-lncRNAs和肿瘤-lncRNAs都可以编码与MHC具有高亲和力结合的肽。 

为了解析uEV-lncRNA是否可以编码出稳定的肽段，作者对PC3、LNCaP 和 HCT116 细胞系进行了蛋白质组学质谱分析，并将MS检测到的肽与来自PC3-lncRNA 的预测编码肽进行了比较，发现了15个uEV-lncRNAs，预测编码768个高亲和力的新抗原，其中三个编码的ORF产生了质谱检测到的未修饰的多肽。然后，核糖体分析数据集观察到，15个lncRNA中有5个与活跃翻译的核糖体相关，并且包含了质谱检测到的未修饰的一个多肽，表明该uEV-lncRNA可翻译并产生稳定的肽。综上表示，uEVs中含有带ORFs的lncRNAs，并且具有很高的翻译潜力。

 

图4 EVs中富集的lncRNA具有翻译功能

 

综上所述，uEVs含有简化的转录组和无内含子的细胞质转录本，以及丰富的lnc/circRNA，并且大多数circRNAs可能来自前列腺细胞系。uEVs中的部分circRNAs和lncRNAs可在细胞间发挥信号转导功能。此外，uEVs中含有带ORFs的lncRNAs，具有很高的翻译潜力。作者将uEVs和体外细胞系EVs中的lnc/circRNAs进行双重分析并解析机制，为未来根据uEVs中lnc/circRNAs的表型鉴定前列腺癌症提供了诊断靶点。 

原文链接：

https://doi.org/10.1002/jev2.12210

参考文献：

[1]Van Niel G, d’Angelo G, Raposo G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles[J]. Nature reviews Molecular cell biology, 2018, 19(4): 213-228.

[2]Hulstaert E, Morlion A, Cobos F A, et al. Charting extracellular transcriptomes in the human biofluid RNA atlas[J]. Cell Reports, 2020, 33(13): 108552.

 

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分类： circRNA功能验证, circRNA生物学, 前列腺癌, 功能机制, 实用工具, 最新重要进展, 高通量测序与生信分析评论

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