先天淋巴细胞（Innate lymphoid cells，ILCs)是一种异质性的淋巴细胞，它能对环境信号做出快速反应，并在调节黏膜免疫、淋巴器官生成和组织稳态方面发挥关键作用[1]。ILCs起源于先天淋巴祖细胞（ ILC pro-genitor cells，ILCPs），可发育为三种亚型：Ⅰ型先天淋巴细胞（ILC1s）、Ⅱ型先天淋巴细胞（ILC2s）和Ⅲ型先天淋巴细胞（ILC3s）[2]。有研究表明，circKcnt2能够通过抑制ILC3来促进结肠炎在体内的消退，而circRNA如何调控ILC3的分化目前还尚未研究清楚[3]。由此可见ILCs在机体免疫反应中具有非常重要的地位，而通过circRNA研究ILCs不同亚型的发育和分化机制，或许对今后研究ILCs在感染性疾病中的免疫功能提供新的思路。
2022年8月11日，中国科学院生物物理研究所感染与免疫重点实验室范祖森研究员作为通讯作者在Nature communications发表文章Circular RNA circTmem241 drives group III innate lymphoid cell differentiation via initiation of Elk3 transcription。研究结果表明，circ-Tmem241在ILC3s中表达丰度最高，且在缺失circ-Tmem241后ILC3s的抗菌免疫功能被减弱。在ILCPs中，circ-Tmem241能够与Nono蛋白相互作用，从而招募组蛋白甲基转移酶 Ash1l到Elk3的启动子上。Ash1l通过组蛋白修饰增强Elk3染色质可访问性，从而起始其转录，并最终影响ILC3s的分化。
在这篇文章中，作者通过RT-PCR等方法从之前研究中[4]发现的circRNA中挑选了前十个高表达circRNA进行验证。经筛选后发现circ-Tmem241在骨髓和消化道组织中表达最高。而在免疫细胞中，circ-Tmem241在ILCPs和肠道ILC3s中表达最高，在缺失circ-Tmem241后ILC3s的数量及其抗菌免疫功能被明显降低。
图1.CircRNA筛选及验证
2、CircTmem241从ILCP阶段驱动ILC3的分化
为了探究circ-Tmem241是否只对ILC3s的分化有影响，作者在circ-Tmem241敲除小鼠中检测了CLPs、α4β7+ CLPs、CHILPs和 ILCPs的细胞数量和细胞占比。结果显示，circ-Tmem241缺失在体内和体外均对ILCPs等细胞的分化数量和占比没有影响。最后，作者在circ-Tmem241敲除的ILCPs中发现其分化为ILC3s的能力被降低，而在异位表达circ-Tmem241时，分化为ILC3s能力得到恢复。这提示，circ-Tmem241在ILC3s分化过程中是必不可少的。
图2.circ-Tmem241功能验证
3、CircTmem241以内在的方式调控ILC3分化
为了进一步验证circ-Tmem241是通过内在还是外在的方式调控ILC3的分化？作者进行了小鼠骨髓移植实验。结果显示，不管在竞争性或非竞争条件下circ-Tmem241都能够影响ILC3的分化。证明circ-Tmem241是以内在方式的调控ILC3的分化及抗菌免疫能力。
图3.小鼠骨髓抑制实验验证circ-Tmem241调控方式
为了探究circ-Tmem241调控ILC3分化的分子机制，作者发现circ-Tmem241刚好能够结合到Elk3启动子-200~0之间的区域，下调Elk3的表达。此外，在敲除circ-Tmem241的ILCPS中过表达Elk3能够恢复ILC3的分化。
图4.circ-Tmem241靶基因筛选及验证
5、CircTmem241能够与ILCPs中的Nono相互作用
为了进一步研究circ-Tmem241是如何调控Elk3基因的表达，作者使用生物素标记的circ-Tmem241转录本进行了pull-down实验。结果显示，circ-Tmem241能够与Nono蛋白相互结合，并且Nono蛋白的N端存在RNA识别motif。此外，过表达Nono蛋白能够显著增项Elk3启动子的荧光素酶活性，敲除Nono能够显著降低Elk3的表达。这提示，circ-Tmem241与Nono蛋白有直接的相互作用。
图5.circ-Tmem241相互作用蛋白筛选及验证
6、CircTmen241在Elk3启动子上招募组蛋白甲基转移酶Ash1l来激活其转录
接下来，作者又对Nono蛋白如何调控Elk3进行了一系列研究，并且发现在pulldown实验中Nono蛋白能够与甲基转移酶Ash1l特异性结合，而circ-Tmem241却不能直接与Ash1l结合。这个结果证明Nono蛋白是circ-Tmem241与Ash1l之间的一个接头蛋白。接着作者又发现，circTmem241可以通过Nono蛋白将Ash1l招募到Elk3启动子上促进其转录，进而调控ILC3的分化。
图6.circ-Tmem241相互作用蛋白筛选及验证
最后，作者进行了一系列体外分化实验来验证circTmem241-Nono-Ash1l-Elk3轴在ILC3s分化中的作用。结果显示，敲除Elk3能够抑制ILC3s的分化，而过表达Elk3能够恢复其分化能力。此外，同时敲除Nono和Ash1l能够抑制ILC3s的分化，而过表达Nono、Ash1l 或Elk3能够恢复ILC3s的分化能力。值得注意的是，在Elk3缺失的ILCPs中仅过表达circTmem241恢复不了ILC3s的分化能力，而同时过表达circTmem241和Elk3能够部分恢复ILC3s的分化。最后，同时敲除circTmem241及Elk3时，ILCPs和ilc3的数量相对较低，并且对细菌感染更敏感。这提示，circTmem241通过Nono-Ash1l-Elk3轴来调控ILC3s的分化，从而影响其抗菌免疫功能。
图7.敲除Elk3可损害ILC3的分化及抗菌免疫功能
综上所述，作者为我们揭示了circTmem241-Nono-Ash1l-Elk3轴在ILCP分化中的重要功能，其在ILC3P和ILC3成熟过程中是必需的，这一发现可能对今后控制ILC在感染性疾病治疗中的发展至关重要。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35953472/
参考文献：
[1] Artis, D. & Spits, H. The biology of innate lymphoid cells. Nature 517,293–301 (2015).
[2] Fuchs, A. et al. Intraepithelial type 1 innate lymphoid cells are a unique subset of IL-12- and IL-15-responsive IFN-gamma-producing cells. Immunity 38, 769–781 (2013).
[3] Zheng, H. et al. The transcription factor Net regulates the angiogenic switch. Genes Dev. 17, 2283–2297 (2003).
[4] Liu, B. et al. An inducible circular RNA circKcnt2 inhibits ILC3 activation to facilitate colitis resolution. Nat. Commun. 11, 4076 (2020).
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