Eur Heart J | 源自胰岛素受体基因的circRNA可防止阿霉素诱导的心脏毒性

在癌症治疗过程中，因抗癌药物副作用诱发患者心力衰竭（HF）进而导致患者死亡的现象十分常见。伴随着抗癌治疗的不断发展和改进，虽然癌症死亡者的数量不断减少，但是由于治疗过程中药物副作用诱发的HF导致死亡的数量却不断增加。其中，以蒽环类药物的临床使用最为典型[1]。 

近年来，对心脏毒性的新治疗靶点的探索取得了新的进展，miRNA和lncRNA已被发现作为心血管疾病（CVD）治疗靶点的临床研究证据[2]。而环状RNA作为一种反向剪切产物，相较于miRNA和lncRNA而言，在生物体内具有更高的稳定性和多种类型的生物学功能。 

2022年6月27号，汉诺威医学院Thomas Thum和Christian Bär共同通讯在European Heart Journal（IF 35.855）发表文章A circular RNA derived from the insulin receptor locus protects against doxorubicin-induced cardiotoxicity，发现Circ-INSR（INSR胰岛素受体）的表达在心脏毒性治疗和心肌细胞重塑过程中的重要性。并且划时代地使用体外制备Circ-INSR，开发出Circ-INSR法用于针对阿霉素诱导心功能不全的一种具有极大转化潜能的治疗方案，印证了CircRNA可作为研发下一代基于RNA心衰治疗药物的靶点。（具体思路详见下文）

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筛选特异性的环状RNA

作者分别在心衰患者和心脏（左心室压力超负荷）重塑小鼠的心脏组织中通过circRNA测序分析、GO富集分析和NCBI筛选出显著低表达且高度保守的Circ-INSR基因。分别在阿霉素诱导的HF患者（人和鼠）心脏组织和体外细胞系中验证了Circ-INSR的低表达。随后，通过 Sanger测序和RNaseR消化再度证明Circ-INSR的环状结构，并通过FISH检测发现Circ-INSR在细胞质定位，并稳定存在。 

图1.Circ-INSR的筛选

 

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验证环状RNA的功能

在阿霉素应激条件下会使细胞活力降低，而在Circ-INSR基因敲低后这一情况会进一步恶化，但是过表达Circ-INSR则可增强细胞活力。并且，小鼠体内实验表明，在阿霉素应激期间，心肌细胞中Circ-INSR的敲低导致代谢活动受损并诱导细胞凋亡，而过表达Circ-INSR则是相反的结果。作者又利用腺相关病毒包装Circ-INSR注射小鼠（阿霉素处理）加已验证Circ-INSR对心脏萎缩的疗效。综上证明，Circ-INSR可调控心肌细胞的代谢活性和存活率，抑制阿霉素诱导的心脏细胞损伤。 

图2.Circ-INSR功能的验证

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Circ-INSR表达调控基因的寻找和Circ-INSR作用机制的探索

 

1.Brca1基因调控Circ-INSR的表达

作者对Circ-INSR的来源机制进行探索，使用RERGNA 2.0软件工具预测潜在的剪接调节基序（Alu元件），发现Brca1是最有希望的调控基因。设计siRNA干扰Brca1可以显著性抑制Circ-INSR的表达；Circ-INSR过表达和Brca1siRNA质粒共转染同样抑制Circ-INSR的表达效果，这提示Brca1是不依赖于宿主基因的Circ-INSR表达的调节基因，可通过调节Brca1基因的表达效果控制Circ-INSR丰度。

图3.Brca1基因的预测

 

2.Circ-INSR与SSBP1的互作

通过探针法对Circ-INSR的pulldown产物进行质谱分析，并对蛋白的结合效率使用GO富集分析验证，又通过CatRAPID算法对与Circ-INSR相互作用的蛋白进行筛选，Circ-INSR和SSBP1（可调节线粒体DNA(mtDNA)的稳定性和自我复制）存在相互作用最终浮出水面。并且RNA pulldown、免疫共沉淀以及FISH荧光定位证实了二者之间的结合关系。

图4.Circ-INSR与SSBP1的互作

 

3.SSBP1是Circ-INSR下游靶基因

首先发现，阿霉素处理的心肌细胞中mtDNA含量显着降低，但在Circ-INSR过表达时得以保留。为了进一步剖析SSBP1和Circ-INSR之间的功能相互作用，我们在HL-1细胞中建立了 SSBP1 过表达和敲低系统，检测线粒体膜电位。Circ-INSR敲低破坏线粒体膜电位，过表达SSBP1能够缓解Circ-INSR低表达对线粒体膜电位的损害作用；相反，SSBP1敲低时，过表达Circ-INSR过表达则对心脏的保护作用失效，这证实了SSBP1在Circ-INSR下游的直接作用。 

图5.SSBP1是Circ-INSR的下游靶基因

04

Circ-INSR初步转化—腺病毒

为了进一步标准化评估Circ-INSR对心脏功能的独特疗效并转化用于HF治疗，作者通过腺病毒包装过表达Circ-INSR用于治疗阿霉素处理的大鼠，发现心肌细胞凋亡现象得以逆转。并且在人心肌细胞上通过检测γ-H2AX阳性细胞率加以验证Circ-INSR对阿霉素诱发的DNA损伤具有保护作用。但是腺病毒作为基因递送载体，有不能长期表达和高免疫原型的限制，特别是在高剂量的情况下可能带来严重的毒性反应。

图6.腺病毒表达Circ-INSR治疗HF

 

05

Circ-INSR升级版转化—体外制备

鉴于腺病毒法表达Circ-INSR用于HF治疗的缺点，作者提出新的表达Circ-INSR的方法—体外制备Circ-INSR，并在大鼠心肌细胞上加以验证。 

1. 夹板法体外制备Circ-INSR

将成环反应所需的“DNA夹板”同连接酶和反应的缓冲液混合配制成反应体系成环来制备人源Circ-INSR。（“DNA夹板”可将3’羟基和5’端磷酸化修饰的单链RNA两末端靠近形成“切口”，经连接酶识别“切口”后，单链RNA相连成环。） 

图7.夹板法体外制备Circ-INSR

 

2. 体外制备的Circ-INSR可预防HF

环化的Circ-INSR被转染到原代大鼠心肌细胞后，Circ-INSR表达水平随时间持续存在，表明环化Circ-INSR的稳定性。随后进行阿霉素处理，与对照和线性Circ-INSR相比，环状Circ-INSR可防止阿霉素介导的DNA损伤及心肌细胞凋亡。这提示，体外转录的Circ-INSR可有效防止阿霉素诱导的HF。 

图8.体外制备的Circ-INSR治疗HF

 

综上所述，作者开发一种更加成熟的环状RNA治疗策略：基于Circ-INSR对阿霉素介导HF的影响，使用体外制备的Circ-INSR，优化了腺病毒自身的不足，针对阿霉素介导的心肌细胞死亡，开创了更优的治疗和保护方案。作者还鉴定了Circ-INSR与SSBP1的物理和功能相互作用，SSBP1在调节心肌细胞凋亡和线粒体膜电位方面发挥作用。除了阿霉素外，作者指出其他蒽环类药物或抗癌药物如紫杉烷类药物也会引起剂量-时间依赖性HF，Circ-INSR在这些心脏毒性模型中可能也很重要，需要广大研究者为此做出进一步的探索。

 

图9. 结构化图文摘要

 

写在最后

由于当时科研技术的滞后性，文中使用了夹板法制备环状RNA，但是也取得了振奋人心的效果。随着人工制备环状RNA方法学研究的深入，国内外企业均投入大量的资金和精力。2017年，laronde开发了一种新型工程化环状RNA平台，用于疾病的治疗；同年，全球首家利用环状RNA技术开发新疗法的ORNA公司创立，通过新型工程化改造的环形 RNA 疗法，克服线性 mRNA 疗法的局限性，用于治疗癌症、自身免疫病、再生医学、遗传性疾病。

2021年，圆因生物在环状RNA新冠疫苗的研发过程中走在前列，在恒河猴身上验证了针对新冠变异毒株有效的环状RNA疫苗；同年，环码生物也立足Ⅱ型内含子自剪切制备环状RNA技术的更新；同年，科锐迈德生物创立，致力于打造全球领先的核酸制药平台；吉赛生物利用原研的环状RNA人工制备专利技术，实现高效率大规模环化，并创造性的改造了普适于内含子剪切的序列重设计方法，在环状RNA的产研道路上一直砥砺前行。新冠病毒席卷全球后，比于其他类型的疫苗来讲，mRNA疫苗的优势是研发速度快，保护有效性高，但其缺点也是显而易见的，比如不稳定，易分解，安全性未知等，而环状RNA能有效弥补mRNA的一些缺点，这也为基于环状RNA的疫苗或药物的开发开辟了道路。体外制备环状RNA技术应用于基础科研研究，必将在基础科研、疫苗研发、癌症诊断和治疗领域大放异彩。 

原文链接：https://doi.org/10.1093/eurheartj/ehac337参考文献：[1].Swain SM, Whaley FS, Ewer MS. Congestive heart failure in patients treated withdoxorubicin: a retrospective analysis of three trials. Cancer 2003;97:2869–2879.

[2].Santer L, Baer C, Thum T. Circular RNAs: a novel class of functional RNA molecules with a therapeutic perspective. Mol Ther 2019;27:1350–1363.

 

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