Mol Ther | 蛋白编码环状RNA circ-EIF6通过编码新肽促进三阴性乳腺癌的进展

乳腺癌(Breast cancer, BC)是威胁女性健康的疾病，全球每年都有很多女性死于乳腺癌。BC是一种异质性疾病，约有15%-20%的BC患者被诊断为三阴性亚型(三阴性乳腺癌[TNBC])[1]，被定义为缺乏雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2型(Her-2)基因表达的亚型[2]，曾有研究报道TNBC因增殖快、转移早、复发率高、缺乏分子靶点治疗而预后较差，成为导致TNBC高死亡率的关键因素[3]，因此，了解TNBC肿瘤发生的分子机制至关重要。

目前对于circRNA发挥作用的机制研究主要集中在circRNA作为miRNA海绵及RNA结合蛋白的支架分子上，蛋白质编码环状RNA由于其特殊的环状特性，能以更稳定的方式表达蛋白质，近年来成为研究的热点。一些文章已经证明了这些环状RNA及其蛋白产物在癌症中的关键作用，包括胶质母细胞瘤、肝癌和结肠癌[4-6]。然而蛋白质编码环状RNA在TNBC中的重要作用尚未被充分研究。

2021 年 8 月 25 日，山东大学齐鲁医院乳腺外科杨其峰教授作为通讯作者在Molecular Therapy发表文章circ-EIF6 encodes EIF6-224aa to promote TNBC progression via stabilizing MYH9 and activating Wnt/beta-catenin pathway。研究发现一种新的蛋白编码环状RNA（circ-EIF6），circ-EIF6通过编码肽段EIF6-224aa，与致癌基因MYH9直接相互作用，抑制泛素-蛋白酶体途径进而激活Wnt/ β -catenin途径降低MYH9降解，促进TNBC细胞在体内和体外的增殖和转移。这为TNBC患者提供了一个潜在的预后生物标志物。

一、circ-EIF6在TNBC中上调，高表达水平预示不良预后

作者为了确定参与BC进展的功能性环状RNA，首先在转移性BC组织和TNBC细胞系的RNAseq中筛选出候选环状RNA，并证实有9个环状RNA显著差异表达。基于表达和98例TNBC患者的预后及临床病理特征，作者选择circ-EIF6作为TNBC细胞中潜在的功能circRNA。结果显示circ-EIF6 (hsa_circ_0060055)在TNBC细胞中表达增加，且与转移能力呈正相关，表明circ-EIF6可能参与TNBC的转移。随后，作者通过系列实验进一步证实了circ-EIF6的环状特征（图1）。

图1.BC中circ-EIF6的鉴定及其特征

二、敲低circ-EIF6可抑制TNBC细胞的增殖、迁移和侵袭

接下来，作者通过功能缺失研究探索circ-EIF6在TNBC中的生物学作用。敲低circ-EIF6后进行了细胞周期、菌落形成、transwell迁移、基质侵袭分析和流式细胞术等功能实验，结果显示敲低circ-EIF6可抑制TNBC细胞的体外增殖、迁移和侵袭（图2）。基于以上结果，作者进一步验证了与细胞周期、迁移和侵袭相关的蛋白水平，结果一致。

图2.敲低circ-EIF6可抑制TNBC细胞的增殖、迁移和侵袭

三、circ-EIF6编码了一个224-aa的新肽EIF6-224aa

基于上述结果，作者进一步探索了circ-EIF6是否通过编码肽发挥功能，通过生物信息学分析，作者发现circ-EIF6包含一个具有核糖体进入位点(IRES)和675 nt的ORF，可能编码一个224-aa的肽(EIF6-224aa)。作者使用双荧光素酶实验证明了IRES的翻译起始能力，再通过构建包含FLAG序列的circ-EIF6载体，检测到EIF6-224aa-FLAG的表达，证实了circ-EIF6具有蛋白编码能力。随后，作者采用液相色谱-串联质谱(LC-MS)成功鉴定出EIF6-224aa的特异性蛋白片段，同时将TNBC细胞系进行MS分析，检测到EIF6-224aa特异肽序列。作者使用EIF6-224aa抗体过表达和敲低后检测EIF6-224aa肽的表达（图3），结果证明circ-EIF6以IRES依赖的方式被翻译为EIF6-224aa，EIF6224aa在TNBC细胞系和组织中内源性表达。

图3. circ-EIF6编码了一个224-aa的新肽EIF6-224aa

四、EIF6-224aa促进TNBC细胞增殖和转移，而circ-EIF6无促进作用

接下来，作者通过体外和体内实验探讨进一步评估circ-EIF6或EIF6-224aa是否负责致癌功能。作者构建了一个缺乏IRES的circ-EIF6-OV，并与circ-EIF6-OV进行比较，采用注射检测circ-EIF6-OV细胞系在小鼠体内的增殖和转移，以确定EIF6-224aa的作用。如图4所示，EIF6-224aa在体内外促进TNBC细胞的增殖和转移而不是circ-EIF6，对照组肿瘤明显小于circ-EIF6-OV组。经hematoxylin and eosin (H&E)染色证实，circ-EIF6OV组较pLCDH组转移明显增加。

图4. EIF6-224aa促进TNBC细胞增殖和转移

五、EIF6-224aa直接与MYH9蛋白相互作用，保护其不被降解

为进一步探索EIF6-224aa的作用机制，作者证实EIF6-224aa与MYH9蛋白相互作用。MYH9蛋白是肌球蛋白II亚家族的成员，在细胞粘附、胞质分裂和维持细胞形态中发挥重要作用。 在方法上，作者对过表达EIF6-224aa- flag的293T细胞进行了免疫共沉淀，沉淀经LC-MS鉴定潜在的相互作用蛋白。在众多候选基因中发现EIF6-224aa可能与MYH9蛋白结合。此外，免疫荧光染色还显示EIF6-224aa和MYH9共定位于细胞质中，提示EIF6-224aa可能与MYH9相互作用。并通过免疫沉淀进一步证实EIF6-224aa/MYH9相互作用。

通过CHX-chase和泛素化分析，在EIF6-224aa- flag过表达载体转染的TNBC细胞中加入蛋白合成抑制剂Cycloheximide (CHX)和蛋白酶体抑制剂MG132，采用western blot法检测MYH9蛋白的表达。如图5G和H所示，过表达EIF6-224aa降低了MYH9的降解速度，说明circ-EIF6表达的内源性EIF6-224aa保护了MYH9的降解。上述结果表明过表达EIF6-224aa降低了MYH9蛋白的泛素化水平，从而保护MYH9免受蛋白酶体降解。

图5. EIF6-224aa直接与MYH9蛋白相互作用

六、EIF6-224aa通过激活MYH9/Wnt/ β -catenin通路促进TNBC进展

作者使用siRNA敲除MYH9以评估MYH9对circ-EIF6/EIF6-224aa致癌功能的影响(图6A)。通过细胞功能实验，结果显示MYH9敲低可以拮抗EIF6-224aa的致瘤作用，细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显受到抑制(图6B-D)，表明MYH9是EIF6224aa的功能靶点。

已有研究报道MYH9的表达与Wnt/ β -catenin通路的激活相关，作者在研究中验证了EIF6-224aa过表达和MYH9敲除对Wnt/ β -catenin通路及下游靶基因的影响。过表达EIF6-224aa后，β -catenin蛋白表达上调，而用siRNA敲除MYH9后，β -catenin蛋白表达下调。下游靶蛋白(cyclin D1、c-Myc、N-cadherin、E-cadherin、vimentin)的表达发生相应变化。此外，作者还检测到了下游靶基因(CCND1、AXIN2、SURVIVIN、LEF1、NKD1和TCF1) mRNA表达的变化，并证明了Wnt/ β -catenin通路中的靶基因通过EIF6-224aa上调，而敲低MYH9可以拮抗EIF6-224aa的作用(图6)。

图6. EIF6-224aa通过激活MYH9/Wnt/ β -catenin通路促进TNBC进展

图7 circ-EIF6调节TNBC增殖和转移的机制示意图

综上所述，作者的研究证明了circ-EIF6 (hsa_circ_0060055)与核糖体相互作用，并被翻译成一个新的肽名为EIF6-224aa。EIF6-224aa直接与MYH9蛋白相互作用，通过降低MYH9的泛素化抑制其蛋白酶体降解，进而激活MYH9蛋白Wnt/ β -catenin通路促进circEIF6的致癌功能。

此外，circ-EIF6在TNBC患者中是一个潜在的预后生物标志物。新发现的编码circ-EIF6拓宽了对TNBC潜在机制的认识，并为TNBC患者的治疗提供了一个潜在的预后和治疗靶点。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2021.08.026

参考文献：

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