占强教授扩展了CRC发病机制中circRNA的作用，为诊断和治疗提供新靶点

图1.circEZH2的筛选和稳定表达验证

图2-1.体外实验结果

 

由于circRNA已被证明可作为竞争性内源性RNA与调节性miRNA相互作用并在转录后水平控制miRNA的表达。作者直接在结直肠癌和癌旁组织中进行测序分析，筛选出140个差异表达的miRNA。同时，作者预测出有四种miRNA（miR-1265、miR-554、miR-556-5p和miRNA-133b）可能是circEZH2的互作伙伴。然后经过数据库预测和miRNA-seq双重分析，最终miR-133b被鉴定可作circEZH2的潜在“伴侣”。RNA免疫沉淀（RIP）和荧光素酶报告基因分析是证明互作的实验标准。RIP结果显示，circEZH2仅和上述四种miRNA中的miR-133b存在结合；同时，检测circEZH2与miR-378b（CRC生成相关的miRNA）的互作结果无效。而荧光素酶报告基因检测circEZH2和miR-133b互作的结果与RIP结果一致。FISH分析也显示circEZH2和miR-133b共定位于HCT116细胞的细胞质中。有趣的是，circEZH2对miR-133b的表达有抑制作用。circEZH2敲低上调miR-133b的表达，而circEZH2过表达效果与之相反。而circEZH2敲低或过表达对上述四种miRNA的表达无作用。这提示，circEZH2在CRC细胞中起到miR-133b海绵的作用，其表达同circEZH2在CRC组织中呈负相关。

图3.circEZH2发挥miR-133b分子海绵作用

 

1.1 circEZH2作为miR-133b海绵影响CRC进展

作者在CRC细胞上建立了稳定的过表达miR-133b。细胞功能实验结果显示过表达miR-133b抑制细胞增殖和迁移能力。随后作者在circEZH2过表达体系中引入过表达miR-133b可消除circEZH2对肿瘤生成的促进作用。这提示，circEZH2可作为miR-133b的分子海绵来影响CRC的进程。

图4.circEZH2发挥miR-133b分子海绵作用影响CRC进程

图5.circEZH2和IGF2BP2之间存在互作

 

circEZH2敲低显著降低了IGF2BP2的蛋白质水平，但对其mRNA水平没有太大影响。因此，推测circEZH2可能直接与IGF2BP2蛋白互作。而值得注意的是，circEZH2敲低促进了HCT116细胞中IGF2BP2的泛素化水平，而circEZH2过表达小鼠肿瘤中的IGF2BP2显示高表达。这提示，circEZH2可通过降低IGF2BP2泛素化水平来促进IGF2BP2蛋白高表达。巧合的是，生信分析显示IGF2BP2是miR-133b的下游靶标。双荧光素酶结果显示二者存在结合。并且IGF2BP2过表达可逆转miR-133b过表达抑制CRC细胞增殖和迁移的效果。综上，m6A阅读器—IGF2BP2是miR-133b的下游靶标，并与CircEZH2产生互作。

 

图6.IGF2BP2与CircEZH2相互作用，并且是miR-133b的下游靶标

图7.circEZH2通过调节CREB1表达来促进CRC进程

综上所述：circEZH2在CRC进展中可充当癌基因。CircEZH2与m6A阅读器—IGF2BP2互作并阻断其泛素化依赖性降解，从而促进CRC中CREB1 mRNA的稳定性。本文扩展了对CRC发病机制中circRNA的作用，并建立了circEZH2/miR-133b/IGF2BP2/CREB1轴为CRC的诊断和治疗提供了一个新的靶点。