肝内胆管癌（ICC）是一种原发性肝癌，其发病率仅次于肝细胞癌（HCC），约占总原发性肝癌的10%-20%。因其具有高度侵袭性，在过去几十年内呈急速上升趋势。因此，揭示相关的致病途径对其治疗策略的发展至关重要。环状RNA (circRNA)是一类由前体mRNA反向剪接或外显子跳跃产生的新型非编码RNA，具有miRNA sponge、结合蛋白以及蛋白翻译等功能。circRNA的异常表达与多种癌症疾病的进展有关，而circRNA在ICC进展中的作用仍需进一步研究。
2022年1月，海军军医大学沈锋团队在Journal of Hepatology发表文章“Circular RNA ACTN4 promotes intrahepatic cholangiocarcinoma progression by recruiting YBX1 to initiate FZD7 transcription”。研究结果表明，hsa_circ_0050898（命名为 CircACTN4）起源于ACTN4 基因的外显子1至外显子 20，在ICC中显著上调。CircACTN4的高表达与体外和体内肿瘤增殖和转移的增强以及ICC切除后较差的预后有关。此外，CircACTN4 通过结合 miR-424-5p上调Yes相关蛋白 1（YAP1）的表达。并且CircACTN4还招募了Y-box结合蛋白 1（YBX1）来刺激Frizzled-7（FZD7）转录。ICC细胞中的CircACTN4过表达增强了Hippo和Wnt信号通路的核心成分YAP1和β-catenin之间的相互作用。因此，CircACTN4可能是ICC潜在的预后标志物和治疗靶点。
经组织芯片分析显示，ICC患者组织中有19个上调的环状RNA，且CircACTN4表达量最高（图1A,B）。qRT-PCR实验证实CircACTN4在ICC组织中呈高表达，且耐受RNase R的消化处理（图1C,D）。此外，作者使用FISH和亚细胞分离试验，在RBE和FRH0201细胞的细胞核和细胞质中观察到CircACTN4转录本（图1F,G）。与CircACTN4低表达相比，ICC中CircACTN4的高表达与其较差的3年总生存率和较高的复发率相关（图1H,I）。
图1.CircACTN4的鉴定及其与ICC预后的关系
二、CircACTN4促进ICC细胞在体内/体外的增殖和侵袭
过表达CircACTN4促进RBE细胞的增殖、迁移和侵袭，并且促进血管生成。而在FRH0201细胞中干扰CircACTN4时，会抑制其增殖、迁移及侵袭（图2A-C）。在异种移植模型中，干扰CircACTN4的表达会抑制肺转移和肿瘤生长，而过表达CircACTN4促进肺转移和肿瘤生长。
图2.CircACTN4促进ICC在体外和体内的增殖、迁移和侵袭
三、CircACTN4调控ICC细胞中FZD7的表达
RNA-seq鉴定出在过表达CircACTN4的RBE细胞中有103个差异表达基因 （图3A, B）。经qRT-PCR验证后表明，过表达CircACTN4能使Hippo/Wnt相关基因在RBE细胞中高度富集（图3C, D）。Western blot显示FZD7、ID2、CCN2和AXIN2的蛋白水平也随着CircACTN4过表达或敲低而改变（图3E）。在ICC细胞中CircACTN4过表达/敲低均能导致Wnt/β-catenin通路的受体FZD7表达升高/降低。TCGA数据库也显示FZD7在ICC组织中的表达水平明显高于非肿瘤组织（图3F）。此外，对组织样本的qRT-PCR、IHC和体内实验也进一步证实了这一结果（图3G，H）。该结果表明CircACTN4可能影响FZD7表达。
图3.CircACTN4上调ICC细胞中FZD7的表达
RNA-pull down和western blotting结果显示，生物素标记的CircACTN4探针可以在FRH0201细胞裂解液中沉淀内源性YBX1（图4A），该结果在RIP和RNA EMSA实验中被证实（图4B,C）。表明CircACTN4和YBX1之间存在相互作用。TCGA数据显示，YBX1在ICC组织中的表达明显高于非肿瘤组织（图4E）。这些结果提示CircACTN4与YBX1相互作用，并在ICC进展过程中启动下游基因转录。
图4.CircACTN4与YBX1相互作用
五、CircACTN4招募YBX1共同激活FZD7的转录
ChIP-seq分析表明，FRH0201细胞中的YBX1结合区广泛分布于基因组中，其中24.88%是启动子（图5A，B）。YBX1结合区的基序分析显示它们的结合序列偏好不同（图5C）。结合RNA-seq和ChIP-seq的结果发现，FZD7是ICC细胞中CircACTN4和YBX1的靶点（图5D）。ChIP-qPCR显示，YBX1与FZD7启动子富集在同一位点（-400bp~-1600bp）（图5E）。此外，YBX1基因敲除抑制了H3K27Ac修饰在FRH0201细胞FZD7启动子上的富集（图5F）。为了进一步证实CircACTN4和YBX1共同调控FZD7的转录，作者敲除了CircACTN4，发现FZD7启动子上YBX1的富集程度减少（图5G）。FZD7 mRNA和蛋白水平的变化也与YBX1过表达和敲低一致（图5H）。以上结果提示CircACTN4可能是YBX1介导的FZD7在ICC细胞中表达所必需的。
图5.CircACTN4招募YBX1共同激活FZD7转录
六、CircACTN4通过吸附miR- 424-5p上调YAP1的表达
经Circular RNA Interactome数据库预测后发现CircACTN4可作为多个miRNA的海绵。通过对比Starbase和Circbase的miRNA靶标预测结果，其中选出12个miRNA为CircACTN4和YAP1的候选靶标（图6A）。但是在转染si-CircACTN4的FRH0201细胞中，只有miR-424-5p表达上调（图6B）。此外，RNA-RIP实验也证实了CircACTN4可以直接与miR- 424-5p结合（图6C）。转染miR-424-5p mimic可导致RBE细胞增殖、迁移和侵袭能力下降（图6D, E）。并且YAP1 mRNA和蛋白水平也显著降低，而miR-424-5p inhibitor的结果正好与之相反（图6F），表明CircACTN4通过海绵作用结合miR-424-5p并调节YAP1的表达。双荧光素酶报告实验显示，与对照组相比，共转染miR-424-5p mimic和野生型荧光素酶报告基因的HEK-293T细胞的荧光素酶活性显著降低（图6G）。在RIP实验中，与IgG组相比，argonaute 2组CircACTN4和miR-424-5p的富集增加（图6H）。这些结果提示CircACTN4可作为miR-424- 5p的海绵在ICC细胞中上调YAP1。
图6.CircACTN4通过浸润miR-424-5p上调YAP1的表达
七、CircACTN4参与Wnt/Hippo信号通路
由于FZD7是Wnt信号通路受体，作者推测CircACTN4可能通过促进FZD7转录参与了该通路的调控。经验证后发现，通过过表达或敲低CircACTN4均能影响β-catenin和p-GSK3b的表达（图7A）。在过表达CircACTN4的RBE细胞中，β-catenin的核定位显著增加，而在表达CircACTN4的FRH0201细胞中，β-catenin的核定位降低（图7B）。TOP/FOP – flash报告实验显示，Wnt/β-catenin通路活性与CircACTN4表达量成正比（图7C）。YAP1和β-catenin共定位于CircACTN4过表达的RBE细胞中，并且CircACTN4能够促进YAP1和β-catenin的核积累。这些结果表明，CircACTN4增强并激活了YAP1/β-catenin和Hippo/Wnt通路的相互作用。
图7.CircACTN4参与Wnt/Hippo信号通路
综上所述，ICC中高表达的CircACTN4通过招募YBX1启动FZD7转录，促进肿瘤的发展。此外，CircACTN4可以与miR-424-5p结合，上调YAP1的表达，并且在ICC肿瘤发生过程中充当Hippo/YAP和Wnt/β-catenin通路之间的交叉点，为今后研究肝内胆管癌的发生和发展提供坚实的理论基础。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34509526/
参考文献：
[1] Chen Qinjunjie,Wang Haibo,Li Zheng et al. Circular RNA ACTN4 promotes intrahepatic cholangiocarcinoma progression by recruiting YBX1 to initiate FZD7 transcription.[J] .J Hepatol, 2022, 76: 135-147.
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