Cell Mol Biol Lett | 蒋利与邱朝晖发现circ_0086296参与动脉粥样硬化作用机制

动脉粥样硬化(AS)是一种慢性严重的炎症反应和动脉壁损伤，也是大多数严重的心血管疾病的罪魁祸首，包括心肌梗死和中风[1,2]。异常内皮细胞(ECs)的丢失和功能障碍是AS的初始阶段，也是AS的关键病理特征之一。因此，了解内皮细胞动脉粥样硬化表型的分子机制可以探索潜在的治疗靶点。

circRNA具有典型的稳定结构和长的半衰期。因此，circRNAs可能作为疾病的生物标记物。越来越多的证据表明，circRNA通过直接与蛋白质结合或通过海绵miRNA改变靶基因水平来调节发育。然而，circRNA生物发生和调控AS中ECs异常表型的机制仍不清楚。

2022年9月23日，上海交通大学医学院附属同仁医院心血管内科蒋利与邱朝晖在Cellular & Molecular Biology Letters上发表了一篇题为circ_0086296 induced atherosclerotic lesions via the IFIT1/STAT1 feedback loop by sponging miR-576-3p的文章，在这篇文章中，作者揭示了 circ_0086296/miR-576-3p/IFIT1/STAT1参与了动脉粥样硬化的过程，并与动脉粥样硬化患者血清外泌体中 circ_0086296的高表达有关。

数据库预测，获得目的circRNA

作者通过微阵列分析筛选了人类斑块组织和对照样本中的circRNA。发现与对照组相比，9个circRNA在人类斑块组织中的表达增加，而3个circRNA的表达降低。在这些差异表达的circRNA中，选择了4个用于qRT-PCR进一步检测：circ_0086296、circ_0009579、circ_0085558和circ_0052089。根据实验数据显示，人脐静脉内皮细胞的circ_0086296水平高于人主动脉VSMCs或THP-1细胞，因此用于进一步研究。

circRNA表达研究

作者通过qPCR验证了氧化型低密度脂蛋白处理人脐静脉内皮细胞可促进circ_0086296的表达。并且发现与对照组相比，动脉粥样硬化小鼠主动脉中circ_0086296的表达水平升高，对其进行RNase R处理，发现具有抗性。FISH检测发现发现circ_0086296主要在细胞质中表达，并且与内皮相关标记CD31在人冠状动脉斑块组织和动脉组织中共定位。

图1.circ_0086296的验证与表征

circRNA表型研究

为了确定circ_0086296在人脐静脉内皮细胞表型调控中的生物学功能，作者建立了稳定的circ_0086296敲低和过表达细胞系，以及各自的对照。CCK-8检测显示，circ_0086296基因敲除逆转了氧化低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞活力的抑制作用，而circ_0086296-OE增加了这些抑制作用。Transwell和Scratch分析表明，circ_0086296基因敲除可减轻氧化低密度脂蛋白损伤的人脐静脉内皮细胞的运动，而circ_0086296-OE细胞具有相反的作用。

下游miRNA研究

作者通过生物信息学分析预测了circ_0086296的ceRNA网络。通过重叠数据集，共筛选出65个miRNAs和11个基因。值得注意的是，miR-576-3p的结果特别令人感兴趣，荧光素酶检测实验表明，circ_0086296野生型报告和miR-576-3P模拟降低了荧光素酶活性，而circ_0086296突变型没有这种作用。RIP实验还表明，用抗AGO2抗体富集了miR-576-3p和circ_0086296。FISH结果表明，circ_0086296与miR-576-3P共存于人脐静脉内皮细胞的细胞质中。实验结果证实了circ_0086296是miR-576-3p的分子海绵。

图2.circ_0086296作为miR-576-3P的海绵

miRNA下游基因研究

circ_0086296与靶基因水平呈正相关，与miR-576-3p呈负相关。作者预测了可能的miR-576-3P靶基因，并对微阵列分析的基因进行了分析。从可能的miR-576-3P靶基因中选择了4个基因(BIRC3、CDC7、NEMP1和IFIT 1)。qRT-PCR结果表明，IFIT1在人斑块组织和ox-LDL处理的HUVEC中显著上调。因此，选择了IFIT1进行进一步分析。结果表明，过表达的IFIT1显著抑制了体外血管生成的能力，而sh-IFIT1逆转了这一效应。为了确定IFIT1是否是miR576-3p的有效靶点，使用了IFIT1 3‘非翻译区(UTR)荧光素酶报告基因(IFIT1-WT)和突变报告基因(IFIT1-mut)。发现IFIT1-WT和miR-576-3p模拟下调的荧光素酶活性，而IFIT1-mut没有这种作用，结果表明IFIT1是miR-576-3p的直接靶点。

circRNA-miRNA-基因轴上表达与表型

为了进一步阐明circ_0086296在体内促进动脉粥样硬化病变中的作用，给动脉粥样硬化小鼠注射了表达sh-NC或sh-circ_0086296的慢病毒。作者发现sh-circ_0086296减少了动脉粥样硬化小鼠主动脉组织的脂质面积。Sh-circ_0086296感染抑制了circ_0086296的表达，增加动脉粥样硬化小鼠主动脉组织中miR576-3p的表达，降低IFIT1的水平。为探讨sh-circ_0086296在体内抑制动脉粥样硬化形成的分子机制，对动脉粥样硬化小鼠主动脉中STAT1-Sting信号进行了检测。体内和体外数据表明，circ_0086296下调介导了STAT1和STING表达的抑制以及STAT1、NF-κB和IRF3磷酸化的抑制。在AS小鼠中，感染表达sh-circ_0086296的慢病毒的斑块和内膜损伤区域被部分抑制。免疫组化结果显示，与sh-NC组相比，sh-circ_0086296组CD31表达增加，IFIT 1表达降低。IFT1的IF结果与IHC的结果一致。同时，酶联免疫吸附试验显示，感染sh-circ_0086296后，AS小鼠的炎症因子水平明显低于sh-NC组。这些数据共同表明，circ_0086296缺陷可能限制体内动脉粥样硬化病变的发展。

外泌体研究

作者从患者和对照受试者的血浆中纯化了外泌体，与对照组相比，AS患者外泌体中circ_0086296水平升高，而miR-576-3p水平降低。为研究人脐静脉内皮细胞是否分泌含有circ_0086296的血管内皮细胞，从人脐静脉内皮细胞培养上清液中获取血管内皮细胞。与体内结果相似，发现氧化低密度脂蛋白处理的人脐静脉内皮细胞与对照组相比，外泌体中circ_0086296水平升高，而miR-576-3p表达较低。作者进一步研究了外泌体包装circ_0086296对人脐静脉内皮细胞动脉粥样硬化病变表型的调节。发现，含有sh-circ_0086296的外泌体能部分恢复人脐静脉内皮细胞的动脉粥样硬化病变表型，而含有circ_0086296-OE的外泌体诱导动脉粥样硬化病变表型。用qPCR检测细胞与sh-circ_0086296细胞来源的外泌体共培养后circ_0086296和miR-576-3p的表达。结果表明，在与sh-circ_0086296细胞来源的外泌体共培养的细胞中，circ_0086296的表达降低。与sh-circ_0086296细胞来源的外泌体共培养后，HUVEC中miR-576-3p的表达增加。总体而言，实验结果表明，外泌体含有circ_0086296-OE，而外泌体诱导了动脉粥样硬化病变表型。

图3.circ_0086296通过miR-576-3P/IFIT1/STAT1诱导的动脉粥样硬化病变示意图

原文链接：https://cmbl.biomedcentral.com/articles/10.1186/s11658-022-00372-2参考文献：[1]Fernandez DM, Giannarelli C. Immune cell profiling in atherosclerosis: role in research and precision medicine. Nat Rev Cardiol. 2022;19(1):43–58.[2]Soltani S, Boozari M, Cicero AFG, Jamialahmadi T, Sahebkar A. Effects of phytochemicals on macrophage cholesterol efflux capacity: impact on atherosclerosis. Phytother Res. 2021;35(6):2854–78.

转载请联系邮箱授权：circRNA@163.com