癌症疫苗是目前最有应用潜力的一种治疗方法。其中，RNA疫苗是未来癌症疫苗发展的新趋势，它能够快速表达抗原，激活机体免疫，并且避免了与基因组整合或T细胞耐受的风险。但是由于mRNA的易降解特性限制了mRNA疫苗的发展。circRNA的特殊的环形结构，使其具有较高的稳定性和RNase抗性，这弥补了mRNA疫苗的不足，因而具有更广阔的应用前景。此前研究报道针对新冠病毒的circRNA疫苗发挥了较mRNA更好的免疫保护作用，但目前尚未有基于circRNA的癌症疫苗被开发出来，因此需要进一步探究circRNA疫苗在肿瘤免疫治疗中的适用性。

 

2022年8月，清华大学林欣团队在Theranostics发表文章“Circular RNA cancer vaccines drive immunity in hard-to-treat malignancies”，在本文中，作者利用circRNA高度稳定且可持续翻译的特性，表达了肿瘤抗原。同时，作者通过将编码抗原的circRNA封装在脂质纳米粒（lipid nanoparticle， LNP）中，建立起一种新的circRNA疫苗平台，使circRNA能够在体内表达。在该平台中circRNA疫苗能够激活机体先天/适应性免疫反应，并在多种小鼠肿瘤模型中显示出优秀的抗肿瘤效果。

一、可翻译circRNA的体外合成

作者利用Permuted Intron-Exon (PIE)系统体外合成circRNA，并利用IRES元件起始翻译。作者通过表达半衰期大约为2 h的Destabilized GFP(D2GFP)，从而鉴定circRNA在体内的稳定性。为了验证剪接反应生成circRNAD2GFP的准确性，作者对生成的circRNAD2GFP进行逆转录，并利用跨Junction位点的引物对产物进行扩增，最后通过Sanger测序确定circRNAD2GFP正确合成。然后，作者利用人源HEK293T和鼠源NIH3T3细胞进行体外实验，并观察到与未修饰的mRNAD2GFP和M1ΨmRNAD2GFP组相比，D2GFP持续存在于circRNAD2GFP组中。统计结果也显示在转染48和72小时后，circRNAD2GFP中D2GFP阳性细胞比率均显著高于其他两组。

Fig1. circRNA和线性mRNA启动蛋白表达

 

二、制备circRNA-LNP复合物

接下来，作者为了验证circRNA疫苗在体内的功能，开发了一种LNP系统。利用该系统将OVA (257-264)-luciferase-coding circRNA (circRNAOVA-luc)包装到LNP中形成稳定的复合体。随后对该复合体进行形态学鉴定，并且证实该复合体在不影响细胞状态的情况下均能在体内/体外进入细胞翻译相应蛋白。由于IRES介导的翻译依赖于IRES反式作用因子，且不同细胞和组织类型的IRES反式作用因子有效性不同。因此，不同的IRES元件甚至相同的IRES元件也可能在不同的细胞种具有不同的翻译启动效果。作者为了优化circRNA在小鼠肌肉组织中的翻译，对四种已知的IRES（CVB3-IRES、EV29-IRES、EV33-IRES、VICP-IRES）进行筛选。经体内外实验验证后，作者发现CVB3和EV29的翻译起始效率最高，并最终选择CVB3进行后续的研究。

Fig2. CircRNA-LNP复合物的体内/外表征

 

三、CircRNA-LNP疫苗可诱导强免疫力

由于先天/适应性免疫反应对抗肿瘤免疫都是必不可少的，所以作者紧接着研究了由circRNAOVA-luc-LNP复合物对机体先天/适应性免疫反应的激活能力。作者首先在小鼠中进行肌肉注射circRNAOVA-luc-LNP疫苗，然后收集小鼠外周血并检测血清中的IL-6和TNF-α。结果显示，注射circRNAOVA-luc-LNP均能增加IL-6和TNF-α的产生，表明其能产生先天免疫反应。为了检测抗原特异性T细胞反应，取小鼠脾脏进行Elispot试验。结果显示，三种circRNAOVA-luc-LNP疫苗均能诱导强大的抗原特异性T细胞应答。最后，作者对小鼠各脏器进行HE染色后发现circRNAOVA-luc-LNP疫苗无副作用。

Fig3. circRNA -LNP疫苗诱导先天/适应性免疫反应

 

四、circRNA-LNP疫苗在免疫排斥皮下肿瘤模型中介导有效的抗肿瘤应答

在之前结果的基础上，作者进一步通过使用MC38-OVA细胞建立免疫排斥小鼠肿瘤模型来评估RNA-LNP疫苗的抗肿瘤效果。在接种两种RNA-LNP疫苗后，小鼠体内肿瘤生长显著降低。并且在第一次疫苗接种后，利用流式细胞术检测小鼠适应性免疫反应。结果显示，与对照组相比，SIINFKL-MHC-I+细胞毒性T细胞显著增加，表明RNA-LNP疫苗触发了抗原特异性T细胞应答。通常，第二次注射疫苗有助于长时间维持免疫反应。所以在第二次疫苗接种后第8天处死小鼠，收集脾脏进行分析并检测IFN-γ和TNF-α的表达。结果显示，两个RNA-LNP疫苗组中IFN-γ分泌均显著增加，而circRNAOVA-luc-LNP组的TNF-α丰度较m1Ψ mRNAOVA-luc-LNP组略有增强。

Fig 4. circRNA-LNP疫苗在MC38皮下肿瘤模型中抑制肿瘤生长并驱动强抗原特异性T细胞应答

 

五、circRNA-LNP疫苗在免疫沙漠原位转移黑色素瘤模型中抑制肿瘤进展

为了验证circRNA-LNP疫苗优益的抗肿瘤性能，作者同样在肿瘤模型构建完成的第6天和15天进行了RNA-LNP疫苗接种。当circRNA-LNP疫苗接种完成后，对肿瘤体积进行测量，当体积达到1cm3时，小鼠被定义为死亡，根据这一原则对小鼠存活率进行分析。实验结果显示，接种PBS组小鼠在接种肿瘤25天内全部死亡，而接种RNA-LNP组小鼠全部存活。在对照组中，肿瘤体积急剧增加，而在接种组中，肿瘤减少到无法检测的水平。为了研究RNA-LNP疫苗是否能阻断肺转移的形成，作者先用两种RNA-LNP疫苗免疫小鼠，然后通过尾静脉注射B16-OVA细胞。在注射肿瘤细胞前一天，在外周血中检测抗原特异性T细胞。小鼠SIINFKL-MHC-I+细胞毒性T细胞的百分比显著增加，这表明接种疫苗已经提供了免疫保护。并且所有接种疫苗的小鼠在肿瘤细胞注射后存活了两个月。这些结果表明，circRNAOVA-luc-LNP和M1Ψ mRNAOVA-luc-LNP引发的免疫应答和抗肿瘤疗效无显著差异，说明circRNA疫苗是改良mRNA疫苗治疗癌症的理想替代品。

Fig 5. circRNA-LNP疫苗抑制B16原位转移瘤模型的进展

 

六、circRNA-LNP疫苗通过与过继细胞移植治疗（adoptive cell transfer therapy，ACT）协同作用诱导晚期肿瘤模型的肿瘤完全消退

由于癌症晚期患者在诊断时通常表现出较高的肿瘤负担，所以联合治疗对消除晚期肿瘤或许更为理想。ACT治疗是一种非常有潜力免疫治疗方法，但因其缺点是在进行治疗时移植的T细胞增殖能力相对不足。所以作者认为肿瘤疫苗能够刺激体内的T细胞，从而产生协同抗肿瘤作用。因此作者通过B16-OVA细胞建立了晚期“免疫沙漠原位模型（immune desert orthotopic model）”，并在接种RNA疫苗前让肿瘤生长11天从而模拟晚期的恶性黑色素瘤。在进行分组治疗后发现PBS组和OT-I组小鼠均在29天内死亡，而疫苗接种组的5只小鼠中有3只存活了60天以上，联合组中所有小鼠均存活了60天以上。其中PBS组和TCR-T组的肿瘤在治疗期间迅速生长。接种组的5只小鼠中有3只肿瘤完全消退。重要的是，联合组肿瘤完全消失，提示circRNA疫苗联合TCR-T治疗策略优于单一治疗策略。为了揭示联合治疗的协同作用机制，将OT-I T细胞转移到CD45.1+ C57BL/6J上，并用circRNAOVA-luc-LNP对其进行免疫。发现联合组OT-1T细胞的百分比明显高于OT-I组，从而证明circRNA-LNP确实增加了TCR-T细胞的持久性。

Fig 6. circRNA-LNP疫苗在B16晚期模型中与OT-I T细胞移植具有协同作用

 

综上所述，在本文中作者通过利用circRNA疫苗表达抗原，解决了mRNA疫苗稳定性较低的难题。通过将编码抗原的circRNA封装在LNP中，作者建立了一种新的circRNA疫苗平台。在该平台中circRNA疫苗能够激活机体强大的先天和适应性免疫反应，并在多种小鼠肿瘤模型中显示出优秀的抗肿瘤效果。最后作者还为我们提供了一种RNA-LNP疫苗联合ACT的治疗方法，为今后在许多难以治疗的恶性肿瘤中开发circRNA疫苗提供了新思路。

近两年来，circRNA疫苗的成功让RNA疗法跃居药物开发前沿，而环形RNA作为RNA疗法开发领域的新兴技术，有望解决线形mRNA面对的多种挑战，因此迅速得到业界的关注。2022年8月，默沙东投入超36亿美元布局环状RNA，也再次显示了环形RNA的广阔潜力。

随着序列设计的不断优化，环化工艺的进一步探索，伴随circRNA的各项技术壁垒也将会逐步打破。国外以Orna ORNA Therapeutics和Laronde为代表，国内环码生物、圆因生物、科锐迈德、吉赛生物等公司先后布局环形RNA技术平台。我们期待这一创新技术能够早日进入临床开发阶段，展现它治疗疾病的潜力。

 

原文链接：

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36168634/

参考文献：

[1] Li Hongjian,Peng Kun,Yang Kai et al. Circular RNA cancer vaccines drive immunity in hard-to-treat malignancies.[J] .Theranostics, 2022, 12: 6422-6436.

 

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分类： 二级结构, 其他肿瘤, 实用工具, 数据库, 最新重要进展评论

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