01 一代测序
Sanger Method又称为双脱氧链终止法，其名字直观地阐述了该测序方法的核心：根据模板在引物上逐个添加ddNTP。
在circRNA研究中，sanger测序主要搭配RT-PCR对目标circRNA进行验证，主要包括以下几种方式：
1-1 Divergent Primer检测BSJ
1-2 不同策略鉴定circRNA全长
②拼接多组primers
③一步到位的滚环PCR
在我们对环状RNA验证时，一般只对“环状RNA特定标识BSJ”进行验证；然而大量证据已表明环状RNA BSJ内部存在着复杂的剪切结构，因此，虽然有相同BSJ，但具体是哪一个isoform发挥功能，仍需要对isoform的全长进行验证。
02 二代测序
随着人类基因组计划的完成，二代测序技术也迎来了它的辉煌时代：2005年Roche 454测序系统发布标志着测序技术正式跨入高通量测序时代。早期二代测序技术手段可谓百花齐放，但被大家熟知的测序仪包括Roche 454、Illumina Solexa以及ABI SOLID；然而短短几年，二代测序市场就基本被Illumina测序仪一家独大，国内市场早已被Illumina测序产品主导；直到2015年，我国终于迎来自主研发的首款测序仪BGISEQ-500，实现了国产测序“从0到1”的突破。
Roche 454乳液PCR技术、Illumina Solid桥式 PCR、ABI SOLID双碱基四色荧光以及华大BGI的DNB技术
mRNA-seq、全转录组RNA-seq以及circRNA-seq的不同建库方式
2-1 环状RNA的检测
• rRNA-deleted library
能够同时检测mRNA,lncRNA等线性RNA以及circRNA。
• rRNA-deleted, RNase R + library
虽然只能检测circRNAs，但通常能够检测到更多circRNA，特别是一些表达丰度较低的circRNA。如果想同时研究circRNA与mRNA的关联，可以对同一批起始RNA进行mRNA-seq。
为了使circRNA更富集，我们也可以先通过加A的方式让线性RNA的3′ 末端更突出（RNase R只能结合到3’单链末端至少包含7个碱基的分子)，从而让线性RNA被RNase R消化得更充分。
测序后我们可以开展一系列与circRNA相关的生物信息学分析，而这一切都要源于对back-spliced junction(BSJ)——RNA是否是环状的唯一标识——的理解和识别。
forward splicing(即Linear splicing) 与 back splicing(即circularization)
识别BSJ是生信软件鉴定环状RNA的核心，然后不同软件会包含一些其他的设置来保证环状RNA的真实性，例如reads在back-spliced site前后最小长度、BSJ侧翼序列是否存在剪切位点、BSJ内部序列长度是否超过某个阈值等。
从2012年到现在，已经有许多经典的鉴定与定量软件被我们熟知，例如find_circ、CIRI、DCC、CIRCexplorer等，这些软件各有各的优点但也有不足（主要是假阳性与敏感性的权衡），因此研究者往往通过联合多款软件对环状RNA进行识别与表达定量。现在虽然已经过了环状RNA鉴定方法开发的喷涌期，但由于不同的实验和技术存在偏倚性，直到现在仍有一些新的软件涌现，例如CARP(Li et.al, 2022)、CiLiQuant(Celine et.al, 2022)。
2-2 环状RNA的多组学研究
下面简单阐述了不同的组学技术对环状 RNA 的研究。
虽说翻译调控（translation regulation）所包含的程序超过了其他调控的总和（Schwanhausser et al., 2011），但我们仍困在哪些环状RNA能够翻译，环状RNA翻译的研究真的是“路漫漫其修远兮”。
当然，现在的项目研究所用到的技术都不是孤立的，我们往往需要整合多组学的技术联合对所观察到的现象进行剖析，例如circRNA m6A研究往往都需要结合RNA-seq，scRNA-seq往往需bulk RNA-seq。只有掌握了这些测序技术的基本原理，我们才能在研究中更游刃有余。
2-3 二代测序的痛点
虽然听起来让人诧异——不是已经有这么多软件能够分析circRNA了吗——这些环状RNA识别与定量也仅仅是通过算法推测，假阳性率甚至达到了45%（Dodbele et.al, 2021）。
为什么这么说呢？主要原因有两点：
• 二代测序固有的缺陷
二代测序由于DNA聚合酶活性等问题，只能检测较短的片段（例如最常用的PE150），因此需要事先对RNA分子进行片段化处理，这一措施很可能导致“circRNA唯一标识BSJ”丢失。
• 环状RNA自身的特征
绝大部分环状RNA表达丰度是极低，因此，在碎片化的RNA文库中circRNA的信号很容易就被掩盖了。
因此，二代测序对环状RNA进行检测一般都需要比mRNA更高的RNA建库起始量，从而保证BSJ分子能够被保留；同时，生信算法也需要足够敏感，但同时又要尽可能地排除假阳性。
二代测序研究环状RNA另一个缺陷是难以检测到环状RNA的中间序列，而大量研究都表明环状RNA存在着复杂的中间结构。为了缓解这一状况，许多根据RNA-seq数据预测环状RNA中间结构的算法被提出，例如CIRCexplorer2、CIRI-full、CircAST等等。
然而，尽管研究人员通过计算方法一定程度提高了二代测序检测环状RNA的准确性，但二代测序固有的局限性以及环状RNA结构的复杂性让我们需要更适合的技术对环状RNA更进一步的刻画。
03 三代测序
在2011年和2014年PacBio以及Oxford Nanopore分别发布了基于聚合酶和基于电信号的商用测序仪。随着技术的成熟和测序价格的下降，在2015年的时候You等研究者就开始使用PacBio检测环状RNA，虽然当时仅仅是12个二代测序来源的环状RNA进行了验证；在2017年Hirsch等人通过Nanopore对circNPM1的剪接异构体的序列组成进行解析；直到2019年，Rahimi等人才通过Nanopore对环状RNA进行了大规模的测序（发表在bioRxiv预印本），不过它采用片段化试剂盒“破环”的方式仍然可能导致环状RNA序列的不完整。
isoCirc通过rRNA-deleted、RNase R对circRNA进行富集，随后用随机引物对circRNA进行反转录，如果反转录后的产物超出了环的长度就用酶进行消化，随后反转录产物被连接成环，最后进行滚环扩增(RCA)。
随后将RCA产物进行Nanopore测序。生信分析鉴别circRNA主要包括滚环一致序列（rolling consesus sequence）以及BSJ识别两个步骤。
CIRI-long通过rRNA-deleted、poly(A) tailing和RNase R充分去除线性分子从而富集circRNA，随后用随机引物进行滚环反转录，再合成2nd链cDNA后进行了最优测序片段的筛选。
Nanopore测序后，用CIRI-long分析策略进行数据分析，分析的关键步骤包括滚环一致序列（cyclic consesus sequence）以及BSJ识别两个步骤。
circNick-LRS通过rRNA-deleted、poly(A) tailing和RNase R充分富集环状分子，随后通过“破环”将环状RNA线性化并添加 poly(A) 尾。
Nanopore 测序后通过pblat查看测得的序列是否包含BSJ位点。
circFL-seq采用的仍然是rRNA-deleted、poly(A) tailing和RNase R富集环状分子的方法，随后用滚环反转录将环状RNA线性化建库。
测序后生信分析方面，circFL-seq提供了包括序列直接进行参考基因组比对（RG）以及通过CCS进行参考基因组比对（cRG）两种方式寻找潜在circRNA。
Illumina在二代测序市场虽然占有绝对的统治地位，但面对测序市场向长读长测序的急速转变，它急需在该领域做出突破。另一方面，Illumina的一些核心专利（例如“修饰核苷酸”和“改良核苷酸”）到期或即将到期，早已被虎视眈眈的二代测序市场将被瓜分（例如华大制造已经发布了多款DNBSEQ产品在美上市的计划），这也迫使Illumina需要在新的领域有所作为。
因此，Illumina在2018年收购三代测序界的翘楚PacBio无果后，在今年1月推出了长读长技术Infinity。9月29日，首届Illumina基因组学论坛宣称Illumina三代测序产品Complete Long-Reads（曾用名Infinity）目前正处于抢先体验阶段，将于2023年正式推出。
当然，“尺有所短，寸有所长”，无论是一代、二代还是三代，它们都有着各自的优势领域，不同的科研问题用不同的技术，而我们只需要按需所取就可以了！