J Hematol Oncol | circRNA-CREIT可降低三阴乳腺癌中的阿霉素耐药性

乳腺癌（BC）是最普遍的恶性肿瘤类型，也是女性癌症死亡的主要原因。三阴性乳腺癌（TNBC）约占所有乳腺癌的15-20%，与其他BC亚型相比，其复发、转移和死亡的风险更高[1]。至今，化学疗法仍然是辅助治疗TNBC的主要选择。然而，伴随治疗过程中产生的耐药性是多因素和复杂的过程，由多种机制驱动[2]。阿霉素（DOX）是临床上最广泛的化疗药物，但是避免不了TNBC患者产生耐药抗性，一旦出现化疗耐药，复发性疾病会迅速发展，这已成为治疗TNBC的主要障碍。因此，迫切需要确定新的治疗靶点以克服TNBC的耐药性。

环状RNA（circRNAs）是一种新型的调控RNA，具有高度进化保守性和稳定性。circRNA有望成为各种恶性肿瘤的潜在诊断生物标志物和治疗靶点。然而，circRNAs在TNBC中的调控功能和潜在机制在很大程度上是未知的。

2022年8月29日，山东大学齐鲁医院乳腺外科行政主任杨其峰在Journal of Hematology & Oncology发表文章CircRNA-CREIT inhibits stress granule assembly and overcomes doxorubicin resistance in TNBC by destabilizing PKR。研究结果表明：DOX诱导形成的耐药型TNBC细胞中的circRNA-CREIT显著下调，而circRNA-CREIT过表达可增强TNBC细胞对DOX的敏感性，促进PKR和E3连接酶HACE1互作，并通过K48连接的多泛素化促进PKR蛋白的蛋白酶体降解，此过程会抑制PKR/eIF2α信号轴，降低应激颗粒(SG)的形成以抑制TNBC肿瘤的生长。并且，circRNA-CREIT可以被包装到外泌体中，在TNBC细胞中传播DOX敏感性。

一、circRNA CREIT在TNBC中表达下调，并增强DOX敏感性

首先，作者通过RNA-seq从6对乳腺癌和癌旁组织中筛选出表达差异最为显著的circRNA-CREIT。通过测序和背靠背验证circRNA-CREIT成环效果，放线菌素D验证其稳定性，FISH验证其定位于细胞质中；并且circRNA-CREIT生成受到RNA结合蛋白DHX9的反向调控。随后作者发现，circRNA-CREIT可能在TNBC的进展中发挥抑制作用。

GO和GSEA分析表明，circRNA-CREIT可能与调节细胞对各种环境压力的反应密切相关，尤其是化学诱导的压力。DOX是TNBC治疗中的化疗药物，circRNA-CREIT在耐DOX的乳腺癌组织和TNBC细胞中下调，其过表达可提高TNBC细胞对DOX的敏感性，敲低则结果相反；作者又构建肿瘤异种移植模型和类器官(PDO)模型，在体内验证了这一结果。

图1. circRNA CREIT在TNBC中表达下调，并增强DOX敏感性

二、circRNA-CREIT的机制探索

1.circRNA-CREIT通过K48连接的多泛素化增强PKR的降解

为了阐明circRNA-CREIT影响敏感性的分子机制，作者运用circRNA pulldown+MS进行研究，在MS鉴定的蛋白质中，PKR因能感知和响应多种类型的细胞应激以及在癌症进展有着重要作用被预定可能与circRNA-CREIT互作。经过NPDock预测、pulldown产物WB检测、FISH共定位以及RIP证明，circRNA-CREIT与PKR存在互作。

随后作者发现过表达circRNA-CREIT抑制PKR蛋白的表达，而敲低circRNA-CREIT则相反。环己酰亚胺（CHX）处理显示，与circRNA-CREIT过表达相比，敲低可增加PKR蛋白的半衰期。提示circRNA-CREIT在PKR降解中起着重要作用。CO-IP结果显示，circRNA-CREIT过表达显著上调PKR的泛素化；并且，circRNA-CREIT过表达增强PKR的K48连接而非K63连接多泛素（K48连接的多泛素通常诱导底物蛋白降解，K63连接的多泛素与蛋白质稳定或活化相关）。上述提示，circRNA-CREIT通过K48连接的泛素-蛋白酶体途径介导PKR降解。

图2. circRNA-CREIT1通过K48连接的多泛素化增强PKR的降解

2.circRNA‑CREIT介导HACE1‑PKR相互作用

有研究表明：环状RNA可以通过充当下游蛋白及蛋白的E3连接酶支架来调节下游蛋白的降解过程[3]。作者通过结合MS和Ubi浏览器，预测HACE1可能是PKR蛋白潜在的E3连接酶。利用ZDOCK软件进行分子对接后预测出HACE1与PKR结合。RNA-pulldown和RIP证实circRNA-CREIT与HACE1结合。随后，HACE1过表达抑制PKR蛋白水平，敲低则相反。并且，HACE1敲低可有效延长PKR的半衰期。Co-IP分析表明：①HACE1过表达增加PKR泛素化，尤其是预期的K48连接泛素化；②PKR和HACE1存在互作。以上结果表示，HACE1可作为PKR的E3连接酶。此外，circRNA-CREIT可以显著增强PKR和HACE1之间的相互作用。这提示circRNA-CREIT可作为PKR和HACE1互作的支架，促进PKR的降解。

图3. circRNA-CREIT介导HACE1-PKR相互作用

三、circRNA-CREIT的应用

1.circRNA-CREIT通过PKR/eIF2α轴减弱了SG的形成

根据以往的报道，PKR激酶可磷酸化eIF2α的丝氨酸残基，触发应激颗粒（SGs，增强癌细胞的耐药性）的形成[4]。作者在TNBC细胞中过表达circRNA-CREIT后发现，DOX的半抑制浓度值明显降低，而过表达PKR可以消除这一效果。这提示，PKR可能介导了circRNA-CREIT对TNBC敏感性的影响。作者发现DOX治疗可触发SG的形成，而circRNA-CREIT过表达可减弱DOX治疗下SG的形成；但PKR过表达会逆转circRNA-CREIT过表达作用。此外，circRNA-CREIT过表达抑制eIF2α的磷酸化，而敲低有着相反的作用。RACK1是一种多功能的支架蛋白，通过与细胞质中的MTK1相互作用，在应激诱导的细胞凋亡中发挥重要作用。DOX处理后触发SG形成，大多数RACK1蛋白转移到细胞核，少数浓缩成细胞质中的颗粒。circRNA-CREIT敲低增强RACK1蛋白的入核以及与SG标记的共定位，并且促进SGs对RACK1的招募。DOX治疗后几乎检测不到RACK1进入细胞质同MTK1作用，但是circRNA-CREIT过表达可促进RACK1与MTK1结合。综上提示，circRNA-CREIT可以阻止SGs招募RACK1，提高TNBC细胞的化疗敏感性。

图4. circRNA-CREIT通过PKR/eIF2α轴减弱了SG的形成

2.circRNA-CREIT与靶向SGs的ISRIB协同作用

小分子ISRIB可逆转eIF2α磷酸化，触发SG分解[5]。作者发现，circRNA-CREIT过表达和ISRIB可发挥协同作用，进一步提高TNBC的药物敏感性。并且，ISRIB可逆转circRNA-CREIT敲低引起的化学耐药性。作者单独使用阿霉素或ISRIB治疗肿瘤模型小鼠可以抑制体内肿瘤生长，而阿霉素和ISRIB的联合使用对抑制肿瘤生长具有协同作用。这提示，ISRIB可与化疗联合用于降低耐药性，治疗TNBC。

图5. circRNA-CREIT与靶向SGs的ISRIB协同作用

3.外泌体circRNA-CREIT赋予TNBC细胞更好的化学敏感性

circRNA可以被包装到外泌体，将耐药性传递给其他细胞[6]。作者分离出circRNA-CREIT外泌体处理细胞发现，circRNA-CREIT外泌体抑制细胞增殖、提高阿霉素敏感性、下调eIF2α的磷酸化水平并弱化SG形成。接下来，作者通过体内小鼠模型实验验证circRNA-CREIT外泌体可降低移植瘤的生长速度。上述数据提示，circRNA-CREIT外泌体可作为治疗TNBC的有效策略。

图6. circRNA-CREIT通过外泌体传递在TNBC中发挥抑瘤作用

综上所述：circRNA-CREIT通过泛素-蛋白酶体系统增强了HACE1介导的PKR降解，从而抑制了PKR/eIF2α信号轴和SG的形成。此外，circRNA-CREIT可以通过外泌体的方式介导TNBC细胞敏感性。临床上，circRNA-CREIT在乳腺癌患者的TNBC组织和血浆中显著下调，而circRNA-CREIT的高表达与良好的预后密切相关。circRNA-CREIT是乳腺癌诊断和预后的潜在生物标志物。靶向circRNA-CREIT和SG的形成可能是提高TNBC敏感性的有效策略。

原文链接：

https://doi.org/10.1186/s13045-022-01345-w

参考文献：

[1] Sung H, Ferlay J, Siegel RL, Laversanne M, Soerjomataram I, Jemal A, et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA 2021;71(3):209–49.

[2] Hu X, Zhang Z. Understanding the genetic mechanisms of cancer drug resistance using genomic approaches. Trends Genet. 2016; 32(2):127–37

[3] Shen S, Yang Y, Shen P, Ma J, Fang B, Wang Q, et al. circPDE4B prevents articular cartilage degeneration and promotes repair by acting as a scafold for RIC8A and MID1. Ann Rheum Dis. 2021;80(9):1209–19.

[4] Chen HY, Lin LT, Wang ML, Tsai KL, Huang PI, Yang YP, et al. Musashi-1 promotes chemoresistant granule formation by PKR/eIF2α signaling cascade in refractory glioblastoma. Biochimica et biophysica acta Molecular basis of disease. 2018;1864(5 Pt A):1850–61.

[5] Sidrauski C, McGeachy AM, Ingolia NT, Walter P. The small molecule ISRIB reverses the efects of eIF2α phosphorylation on translation and stress granule assembly. eLife. 2015;4

[6] Xu J, Ji L, Liang Y, Wan Z, Zheng W, Song X, et al. CircRNA-SORE mediates sorafenib resistance in hepatocellular carcinoma by stabilizing YBX1. Signal Transduct Target Ther. 2020;5(1):298.

转载请联系邮箱授权：circRNA@163.com