胰腺癌（PC）是一种具有毁灭性的恶性肿瘤，特点是：诊断延迟、转移、发生率高、预后不良和化疗不敏感[1]。值得注意的是，PC患者的五年生存率低于5%，并且重要特征是缺氧[2]。尽管外科手术和化学疗法一直在发展，PC的预后仍然令人失望。因此，迫切需要确定PC的早期诊断生物标志物、分子机制和功能治疗靶点。

circRNA（环状RNA）是一种通过选择性剪接形成的非编码RNA。circRNA的环状结构使其难以在体内降解，并在肿瘤和血清外泌体中特异性表达。因此，circRNA可被视为肿瘤发生的有效RNA生物标志物。就机制而言，研究表明circRNA可能通过充当ceRNA来海绵miRNA或充当支架来调节肿瘤进展[3]。并且外泌体携带的circRNA可在细胞间通信中发挥重要作用。

上海交通大学医学院瑞金医院胰腺疾病中心普通外科沈柏用教授在Journal of Hematology & Oncology 发表文章：Hypoxia-induced exosomal circPDK1 promotes pancreatic cancer glycolysis via c-myc activation by modulating miR-628-3p/BPTF axis and degrading BIN1。文章指出：circPDK1在PC肿瘤组织和血清外泌体中高度丰富，并与PC不良生存率相关。外泌体circPDK1在体外和体内显著促进PC细胞增殖、迁移和糖酵解。从机制上讲，HIF1A通过激活宿主基因PDK1上调circPDK1，circPDK1通过调节miR-628-3p/BPTF轴和降解BIN1激活c-myc，从而促进PC生成。本文章提出，外泌体circPDK1可能是PC诊断和预后的潜在生物标志物和治疗靶点。

 

01、RNA-seq测序鉴定低氧PC细胞外泌体中的环状RNA

缺氧可增加PC细胞的外泌体分泌。而circRNA在外泌体中大量稳定存在，在癌症中可能是关键调控因子，这已被广泛证实[4]。作者使用RNA-seq测序检测从常氧和低氧PC细胞中纯化的外泌体，共鉴定出78个差异表达的circRNA，用qRT-PCR在癌症和癌旁组织中，分析前5个上调和下调的circRNA，发现circPDK1是PC中上调最多的circRNA。然后，在大量的癌症和癌旁的组织芯片中进行ISH检测，结果显示，circPDK1在肿瘤组织中比在配对的正常组织中更丰富。随后，作者又选取110例配对的术后PC组织和正常组织，采用qRT-PCR方法分析circPDK1的表达。结果显示，circPDK1在PC中显著上调，并与淋巴结转移、晚期病理分期和不良预后呈正相关。

circRNA在血清外泌体中被广泛检测到，并被认为是血清外泌体中潜在的肿瘤标志物。因此，为了探索circPDK1是否可以在血清外泌体中检测到，以及它作为肿瘤标志物的潜力，作者收集了20名PC患者和10名健康个体的血液样本作为对照。结果发现，来自血清外泌体的circPDK1在PC患者中大量表达，而在健康对照组中几乎不存在。综上所述，circPDK1在PC中显著上调，并与PC的不良预后相关，可在血清外泌体中稳定传递和富集。这表示，circPDK1可作为PC的早期诊断的circRNA生物标志物。

图1. RNA-seq测序鉴定低氧PC细胞外泌体中的circPDK1

02、circPDK1特性

circPDK1 (has_circ_0057104)由PDK1的第7-10外显子生成，长度为401 nt，通过Sanger测序和背靠背引物验证鉴定circPDK1的成环效应。RNase R或放线菌素D处理表明，circPDK1在PC细胞中稳定。亚细胞分离和FISH分析结果显示，circPDK1主要定位在细胞质。这些结果表明，circPDK1在PC中是一个丰富的、稳定表达的细胞质circRNA。

图2.circPDK1特性

 

03、缺氧环境下HIF1A促进外泌体circPDK1表达

有研究表明，在缺氧条件下，大量外显子衍生的circRNAs被HIF1A转录激活，其宿主线性基因由相同的pre-mRNA产生[5]。因此，作者推测低氧外泌体中大量的circPDK1可能是由于HIF1A激活的缘故。为了验证假设，作者首先发现circPDK1与其线性基因表达存在正相关。与此同时，circPDK1的表达也跟HIF1A的表达呈正相关。另外也发现HIF1A蛋白水平在PC中上调。作者又利用启动子序列分析工具(UCSC和JASPAR)，在circPDK1启动子区域的宿主基因中验证了两个潜在的缺氧响应元件(HREs) (ACACGTGCCC/GTACGTGAGG)。通过双荧光素酶报告实验确认HIF1A直接与circPDK1的两个转录起始位点相互作用。此外，对宿主基因上游的circPDK1启动子区域的两个预测HREs进行ChIP分析表明，HIF1A可以直接结合PDK1启动子区域，并在缺氧条件下增强宿主基因PDK1的转录。此外，HIF1A的敲低显著抑制了缺氧诱导的胞内和外泌体circPDK1的表达。ChIP实验结果表示，在缺氧条件下circPDK1可以被激活。总之，这些结果表明，低氧下HIF1A的激活会上调外泌体中circPDK1表达。

图3.缺氧环境下HIF1A促进外泌体circPDK1表达

 

04、细胞功能研究——缺氧下外泌体circPDK1促进PC细胞体外和体内增殖和迁移

体外细胞实验——为了阐明缺氧下，外泌体circPDK1在PC中的作用，从MIA PaCa-2和PANC-1细胞中分离出不同丰度的circPDK1外泌体，并分别在常氧/低氧条件下（常氧外泌体、低氧外泌体、低氧NC外泌体和低氧sh1-circPDK1外泌体）与相应的供体细胞共培养。结果发现，低氧下，外泌体中circPDK1显示高丰度；但是，低氧的sh1-circPDK1组较低氧NC组，circPDK1的表达量下调。接下来，进行集落形成、EdU、CCK-8和transwell检测。结果显示，低氧外泌体处理过的PC细胞活力和迁移能力增强/E-cadherin低表达/N-cadherin和vimentin高表达，而敲低circPDK1则逆转这一结果。

体内裸鼠实验——为了探讨外泌体circPDK1在体内的恶性作用，作者建立了裸鼠异种移植瘤模型(MIA PaCa-2细胞系)，并每3天静脉注射各组小鼠一次MIA PaCa-2产生的外泌体(常氧外泌体、缺氧外泌体、缺氧NC外泌体和缺氧sh1-circPDK1外泌体)。注射完成后，取小鼠肿瘤组织，发现低氧的NC外泌体（circPDK1高表达）增加了异种移植瘤的体积和重量以及肺转移结节，而低氧的sh1-circPDK1外泌体消除了这一结果。IHC检测PCNA、E-cadherin和vimentin发现，circPDK1高表达也促进PCNA和vimentin表达以及/N-cadherin低表达，而sh1-circPDK1结果与之相反。体内与体外实验结果一致，均表明缺氧诱导的外泌体circPDK1在体内促进PC细胞生长和迁移。

图4.缺氧下外泌体circPDK1对PC细胞功能的影响

 

05、机制探索1——在PC中circPDK1起miR 628 3p海绵的作用

鉴于circPDK1定位于细胞质，作者假设circPDK1可能通过作为miRNAs海绵发挥ceRNA的作用。通过circinteractome数据库和RIP实验验证了circPDK1与AGO2结合。这显示，circPDK1可能起到miRNA海绵的作用。随后，miRNA测序来筛选对照组和circPDK1过表达组中的差异表达的miRNA。在候选的miRNA中，miR-628-3p在过表达circPDK1的MIA PaCa-2细胞中被严重抑制，并且RIP实验也表明miR-628-3p可以与AGO2结合。作者进一步在TCGA和自己的数据中发现，miR-628-3p在PC肿瘤中显著下调并与与不良预后相关，并且与circPDK1表达呈负相关。作者通过双荧光素酶报告基因检测发现miR-628-3p和circPDK1存在结合。此外，亦做了circPDK1对miR-628-3p的启动子区域、pri-miRNA和pre-miRNA的影响，排除了circPDK1调控miR-628-3p的启动子活性或pri-miRNA和pre-miRNA生成。综上所述，circPDK1可能与miR-628-3p相互作用，在PC细胞中充当miR-628-3p的ceRNA海绵。

图5.circPDK1发挥miR 628 3p分子海绵作用

 

5-1、circPDK1作为miR-628-3p的ceRNA促进BPTF的表达

miR-628-3p在PC中的潜在功能和作用机制尚不清楚。因此，作者探索了circPDK1-miR-628-3p轴的潜在靶点—使用mirDIP、RNAInter、miRDB、miRTarBase和TargetScan数据库，预测BPTF、PURA、RBFOX2和ARSJ是miR-628-3p的潜在下游靶点。TCGA数据分析显示，BPTF的表达与miR-628-3p呈负相关，而PURA、RBFOX2和ARSJ结果不同。circPDK1缺失后的RNA测序结果显示，在37个下调的蛋白质编码基因中，BPTF是明显下调的基因之一。此外作者通过基因集富集分析(GSEA)发现，BPTF是c-myc转录所必需的。也有报道BPTF/c-myc轴参与了PC细胞生长[6]。双荧光素酶实验证实，miR-628-3p和BPTF存在结合，并且BPTF与circPDK1表达表达水平呈正相关，但是miR-628-3p的过表达会抑制circPDK1激活BPTF/c-myc轴。总体而言，circPDK1作为ceRNA通过发挥miR-628-3p海绵作用，释放miR-628-3p抑制的BPTF，从而调节BPTF/c-myc轴，促进PC生成。

图6.circPDK1作为ceRNA促进BPTF的表达

06、机制探索2——circPDK1与BIN1相互作用，增强BIN1的泛素化

作者使用RNA pulldown实验和银染研究了circPDK1是否通过与RNA结合蛋白相互作用来发挥其功能。结果发现大量的200、120、75、65和35 kDa蛋白与circPDK1相关。质谱分析显示，BIN1是circPDK1最可能的RNA结合蛋白之一。随后，RNA pulldown和免疫沉淀验证BIN1与circPDK1互作。FISH分析显示circPDK1在细胞质中与BIN1共定位。敲低circPDK1虽不改变BIN1的mRNA水平，但可上调BIN1蛋白水平，反之结果相反。作者特异研究了与BIN1相互作用的circPDK1区域，发现主要是circPDK1后半段序列与BIN1相互作用。因此，作者假设circPDK1可能通过与BIN1蛋白相互作用而破坏它。并通过实验验证，敲低circPDK1显著抑制BIN1的泛素化水平，反之则增强了BIN1的泛素化水平。作者又运用原子旋转等变记分器(ARES)分析circPDK1与BIN1结合的三维结构，并找出了它们的结合位置是在BAR区域，随后又设计了pulldown和IHC试验加以验证。综上所述，circPDK1可能通过与BIN1的BAR结构域相互作用来调节BIN1的稳定性，从而促进其泛素依赖性降解。

图7.circPDK1与BIN1相互作用，增强BIN1的泛素化

 

6-1、circPDK1作为支架，增强了BIN1与UBE2O的结合

为了进一步解析circPDK1介导的BIN1泛素化，作者通过质谱分析RNA puldown产物筛选出UBE2O（可显示E2泛素结合酶和E3泛素连接酶活性）。RNA pull-down和RIP确认了circPDK1与UBE2O之间的相互作用。而Co-IP(免疫共沉淀)结果显示UBE2O也与BIN1结合。巧的是，FISH和IF检测表明circPDK1、UBE2O和BIN1主要在细胞质中共定位。qRT-PCR结果显示，UBE2O不影响BIN1和circPDK1的RNA水平，但UBE2O下调后BIN1蛋白水平明显升高。而敲低circPDK1显著减弱了UBE2O对BIN1泛素化和降解的影响。IHC实验还显示，PC组织（circPDK1高表达）中UBE2O蛋白水平升高，且与BIN1呈负相关。总的来说，circPDK1可以作为一个支架，增强UBE2O与BIN1的结合，从而促进UBE2O对BIN1泛素化和降解的影响。

图8.circPDK1作为BIN1与UBE2O结合的支架

 

07、circPDK1通过激活c myc促进糖酵解

有报道讲，BIN1是一种肿瘤抑制因子，可与c-myc相互作用，限制c-myc的转录活性[7]。作者通过双荧光素酶实验验证，circPDK1和UBE2O可以通过降解BIN1蛋白激活c-myc的转录活性。为了探索这两个轴之间是否存在交叉激活，作者检测了BIN1和UBE2O对miR-628-3p和BPTF表达的影响。结果表明，BIN1和UBE2O不影响miR-628-3p或BPTF的表达。同时，miR-628-3p或BPTF不能在RNA或蛋白质水平调控BIN1或UBE2O，这表明circPDK1可以通过两个无交叉的轴激活c-myc。

已知c-myc是Warburg效应的关键介导因子，它直接激活各种糖酵解靶基因，以满足快速增殖和转移的需要[8]。因此，作者探索了circPDK1是否与糖酵解相关。通过qRT-PCR和Western blotting对糖酵解基因进行分析，结果发现，敲低circPDK1对这些糖酵解基因的表达没有明显的抑制作用，仅仅是减少乳酸和ATP的产生和葡萄糖的摄入，以及细胞外酸化率(ECAR)和耗氧率(OCR)。但是PET-CT扫描显示敲低circPDK1会显著抑制小鼠皮下肿瘤中的葡萄糖代谢，并且敲低circPDK1会抑制c-myc活性。进一步的研究发现，BIN1逆转了circPDK1过表达诱导的糖酵解，miR-628-3p结果与之类似，二者也均能抑制c-myc活性。同时，敲低circPDK1和过表达BIN1也会抑制UBE2O诱导的糖酵解电位。总的来说，这些数据表明c-myc介导了circPDK1在糖酵解中的作用。

图9.circPDK1通过激活c myc促进糖酵解

综上所述：circPDK1在低氧PC细胞衍生的外泌体中高度富集。高表达的circPDK1表达与PC患者不良预后密切相关。外泌体circPDK1通过促进细胞生长、转移和体内外糖酵解，在PC中具有促进肿瘤生长的作用。机制上讲，HIF1A通过激活宿主基因PDK1上调circPDK1，circPDK1通过调节miR-628-3p/BPTF轴和降解BIN1激活c-myc。这项研究为circRNA/miRNA/mRNA和circRNA-RBP相互作用的多样性提供了新的见解，并强调了其作为PC的生物标志物和治疗靶点的潜在用途。

摘要图

 

原文链接：

https://doi.org/10.1186/s13045-022-01348-7

参考文献：

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[3] Chen LL. The expanding regulatory mechanisms and cellular functions of circular RNAs. Nat Rev Mol Cell Biol. 2020;21:475 90.

[4] Li Y, Zheng Q, Bao C, Li S, Guo W, Zhao J, et al. Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis. Cell Res. 2015;25:981 4.

[5] Zeng Z, Zhao Y, Chen Q, Zhu S, Niu Y, Ye Z, et al. Hypoxic exosomal HIF- 1α-stabilizing circZNF91 promotes chemoresistance of normoxic pancre- atic cancer cells via enhancing glycolysis. Oncogene. 2021;40:5505 17.

[6] Richart L, Carrillo-de Santa Pau E, Río-Machín A, de Andrés MP, Cigudosa JC, Lobo VJS, et al. BPTF is required for c-MYC transcriptional activity and in vivo tumorigenesis. Nat Commun. 2016;7:10153.

[7] Kinney EL, Tanida S, Rodrigue AA, Johnson JK, Tompkins VS, Sakamuro D. Adenovirus E1A oncoprotein liberates c-Myc activity to promote cell proliferation through abating Bin1 expression via an Rb/E2F1-dependent mechanism. J Cell Physiol. 2008;216:621 31.

[8] Stine ZE, Walton ZE, Altman BJ, Hsieh AL, Dang CV. MYC, Metabolism, and Cancer. Cancer Discov. 2015;5:1024 39.

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