心梗、心力衰竭等心血管疾病的发病率随着年龄的增长而增加。随着一个人不断衰老，人体机能也不断下降，但是其潜在的分子机制在很大程度上仍然未知。主要原因之一是缺乏合适的动物模型。所以建立心肌细胞(CM)特异性衰老动物模型，揭示其潜在机制，从而开发治疗衰老等相关心功能障碍的新疗法，是非常有前景的。

环状RNA (circRNAs)是一类单链RNA，它可形成闭环结构，具有调控功能。以往的研究表明，circRNA可发挥分子海绵机制促进梗死心肌细胞的生成和延缓衰老等效果；在长寿果蝇中，circRNA可以延长寿命[1]。种种迹象表明，circRNA对于抵抗衰老伴随的心力衰竭是一种新的思路。

苏州大学第一附属医院李阳欣教授在Theranostics上发表文章：circHIPK3 prevents cardiac senescence by acting as a scaffold to recruit ubiquitin ligase to degrade HuR。文章分析了来自年轻和衰老心脏的circRNA，发现circHIPK3表达在心脏衰老过程中急剧下降。建立了CM特异衰老模型CKO小鼠发现，敲除circHIPK3将导致CM的过度衰老和心功能下降。机制在于，circHIPK3可作为支架，增强了E3泛素连接酶β-TrCP与HuR在细胞质中的结合，导致HuR的泛素化和降解，降低了p21（衰老标志物）活性。此外，UMSC-Exos通过传递circHIPK3可发挥抗衰老和心脏保护作用。这些发现为开发与衰老相关的心功能障碍的新疗法铺平了道路。

 

一、circRNA在年轻和中年小鼠心脏中的表达及影响

首先，作者将年轻和衰老小鼠心脏进行RNA-seq，分析得到circHIPK3来源于HIPK3基因外显子2，是一种高表达且高度保守的circRNA。又检测circHIPK3在小鼠心、肝、脾、肺和肾脏等组织中的表达发现，circHIPK3的表达在心脏中表达最多。随后作者发现circHIPK3在心脏中的表达水平随着年龄的增长而降低。提示，circHIPK3可能在心脏衰老的发展中发挥重要作用。

RNase R外切酶处理结果显示，circHIPK3耐消化。设计敲低circHIPK3能够降低H9C2细胞中的circHIPK3水平，β-Gal染色水平升高，而过表达circHIPK3的结果相反。除此之外，过表达circHIPK3后，H9C2中衰老标志物p16和p21的mRNA和蛋白水平显著降低，而沉默circHIPK3后，衰老标志物p16和p21的mRNA和蛋白水平升高。这些结果表明circHIPK3在H9C2细胞系和原代CMs中都能防止细胞衰老。

图1.circRNA在年轻和中年小鼠心脏中的表达及影响

 

二、 circHIPK3的敲除诱导小鼠心脏衰老

为了证实circHIPK3在心脏衰老中的作用，作者CRISPR/Cas9技术生成了CM特异性的circHIPK3敲除(KO)小鼠（删除小鼠HIPK3基因外显子2的下游SIN序列），抑制了circHIPK3的环状化，降低了circHIPK3的水平。实验发现，与同窝的circHIPK3 Flox/Flox小鼠相比，KO小鼠的心功能下降，小鼠端粒长度缩短，p16和p21表达增加，小鼠的繁殖速度非常慢，这表明circHIPK3的缺失损害了发育。这些数据表明，circHIPK3缺失导致心脏早期衰老和心功能障碍。

有研究报道，αMHC驱动的Cre酶可能影响心脏细胞生物学。为了确定Cre酶的潜在作用，作者比较了Cre小鼠和CKO小鼠心脏中circHIPK3的表达和心脏功能。数据表明，与Cre小鼠相比，CKO小鼠心脏中circHIPK3水平下降，心功能受损。为了证实circHIPK3在心脏衰老中的保护作用，作者在CKO小鼠中注射了慢病毒过表达circHIPK3 (LV-circHIPK3)，结果表明，LV-circHIPK3改善CKO心功能。这些结果表明，心肌细胞中circHIPK3的缺失导致心脏衰老和生存不良。

图2.circHIPK3的敲除诱导小鼠心脏衰老

三、 circHIPK3调控HuR蛋白表达

为了了解为什么circHIPK3缺失会导致p21上调，作者通过circRNA相互作用网站(https://circinteractome.nia.nih.gov/)分析了circHIPK3可能的靶蛋白。分析没有发现p21或p16是circHIPK3的靶点，但是在人源中发现HuR和circHIPK3之间有三个结合位点。随后RPISeq分析(http://pridb.gdcb.iastate.edu/ RPISeq)证实circHIPK3在小鼠中与HuR结合，且HuR蛋白在人和小鼠之间高度保守。通过PPI数据库(https://www.string-db.org/)分析发现，HuR通过调节SIRT1、细胞周期相关蛋白和端粒长度参与衰老的发展，这表明HuR蛋白可能直接参与衰老过程。重要的是，HuR与p21 mRNA 3′-UTR区域的ARE结合，增加其稳定性，最终导致p21蛋白在细胞质中的表达增强。

既往研究表明，HuR主要位于细胞核内，但在缺血、缺氧、紫外线照射下可向细胞质转移[2]。作者假设circHIPH3通过抑制HuR向细胞质的转运或增加HuR降解，从而导致p21 mRNA的不稳定来防止衰老。WB和免疫荧光结果发现，CKO小鼠心脏细胞质的HuR升高。有趣的是，对照组和circHIPK3 CKO小鼠心脏中HuR蛋白表达上调，但是HuR mRNA的表达没有差异，并且沉默或过表达circHIPK3也不能改变H9C2细胞中HuR mRNA的表达。但是，过表达circHIPK3时，H9C2细胞中HuR总蛋白水平下降，而沉默circHIPK3时，结果相反。这些结果表明，circHIPK3可以决定HuR的定位，调控HuR的表达。

图3.circHIPK3调控HuR蛋白表达

 

四、 circHIPK3作为HuR和E3泛素连接酶的支架，促进HuR降解

前期研究表明，HuR可通过泛素-蛋白酶体途径与E3泛素连接酶β-TrCP相互作用降解[3]。事实上，在PPI数据库中可以找到HuR与E3泛素连接酶β-TrCP之间的相互作用。作者试图用特定的蛋白酶体抑制剂MG132处理H9C2细胞，以阻止蛋白质通过蛋白酶体降解，以确定circHIPK3诱导的HuR蛋白下调是否由泛素-蛋白酶体系统介导。MG132处理增强了敲低circHIPK3诱导的HuR在细胞质中的积累，说明HuR被蛋白酶体降解，而敲低circHIPK3细胞中相对较高的HuR水平是由于抑制了HuR的降解。RNA-pulldown+WB判定circHIPK3和HuR之间的结合，RIP实验和qRT-PCR再次验证二者结合。这表明circHIPK3可能通过直接相互作用调节HuR稳定性。

作者进一步研究了circHIPK3是否通过泛素-蛋白酶体系统调控HuR降解。RPISeq预测显示circHIPK3不仅能与HuR结合，还能与泛素连接酶β-TrCP结合。RIP实验证实circHIPK3与β-TrCP之间存在直接相互作用。Co-IP表明，敲低circHIPK3削弱了HuR与β-TrCP之间的相互作用，并降低了HuR的泛素化。RIP实验显示敲低circHIPK3增强了HuR蛋白与p21 mRNA的相互作用。

为了确定HuR在p21 mRNA表达中的作用，作者用RNA合成抑制剂(放线菌素D)处理细胞，发现HuR沉默后，p21 mRNA的半衰期从5.2 h下降到3.5 h，说明HuR可以增加p21 mRNA的稳定性。为了确定敲低circHIPK3是否通过抑制HuR来促进p21的表达，作者用siRNA敲除了circHIPK3和HuR。WB结果显示，敲低HuR逆转了敲低circHIPK3对p21表达的影响，表明circHIPK3通过调控HuR抑制p21水平。这些结果表明，circHIPK3增强了HuR和β-TrCP的相互作用，通过泛素-蛋白酶体途径降解HuR，导致p21表达降低。

图4.circHIPK3作为HuR和E3泛素连接酶的支架，促进HuR降解

 

五、 外泌体通过释放circHIPK3来防止CM衰老

外泌体含有非编码RNA，包括microRNA、lncRNA和circRNA。有研究表明，UMSC-Exos可抑制衰老引起的血管功能障碍和心功能障碍[4]。作者发现circHIPK3在外泌体中富集。外泌体circHIPK3处理可导致H9C2细胞中circHIPK3表达上调，并促进H9C2细胞增殖，抑制衰老，降低p16和p21的表达。不过，敲低circHIPK3可抑制外泌体对衰老的保护作用。这些结果表明，外泌体通过传递circHIPK3促进H9C2细胞增殖并抑制其衰老。

为了确定外泌体是否通过传递circHIPK3来保护心脏免受心脏衰老，作者通过尾静脉注射PBS、外泌体(NC-Exo)和circHIPK3沉默外泌体(si-Exo)。结果发现注射外泌体的小鼠心脏功能改善、circHIPK3水平升高、端粒长度延长、p16和p21 mRNA和蛋白水平降低。然而，敲低circHIPK3抑制了外泌体发挥的这些有益作用。

图5.外泌体通过释放circHIPK3来防止CM衰老

小结

在本研究中，作者成功构建了CM特异性circHIPK3敲除(CKO)小鼠模型，并表明CKO小鼠表现出CM衰老增加和心功能下降。circHIPK3直接与HuR和E3连接酶β-TrCP结合，作为支架，通过UPS促进HuR的降解，从而阻止HuR与p21的结合，降低p21mRNA的稳定性，抑制心脏衰老。此外，重要的是，作者证明了外泌体可递送circHIPK3改善了CKO小鼠的心功能。

图6.circHIPK3/HuR/p21在心脏早衰中的调控机制

原文链接：

doi:10.7150/thno.77630

参考文献：

[1] Zheng Q, Bao C, Guo W, Li S, Chen J, Chen B, et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nat Commun. 2016; 7: 11215.

[2] Sun Q, Tripathi V, Yoon JH, Singh DK, Hao Q, Min KW, et al. MIR100 host gene-encoded lncRNAs regulate cell cycle by modulating the interaction between HuR and its target mRNAs. Nucleic Acids Res. 2018; 46: 10405-16.

[3] Lan Y, Xiao X, He Z, Luo Y, Wu C, Li L, et al. Long noncoding RNA OCC-1 suppresses cell growth through destabilizing HuR protein in colorectal cancer. Nucleic Acids Res. 2018; 46: 5809-21.

[4] Zhu B, Zhang L, Liang C, Liu B, Pan X, Wang Y, et al. Stem cell-derived exosomes prevent aging-induced cardiac dysfunction through a novel exosome/lncrna malat1/nf-kappab/tnf-alpha signaling pathway. Oxid Med Cell Longev. 2019; 2019: 9739258.

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分类： circRNA-蛋白互作, circRNA功能验证, circRNA生成, circRNA过表达, 功能机制, 实用工具, 心血管疾病, 数据库, 高通量测序与生信分析评论

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