引言.
circRNA独特的功能和稳定的结构让它有望成为许多疾病的生物标志物，然而同源线性RNA往往会干扰circRNA的检测，这成为了circRNA临床检测的绊脚石。为了克服这一困难，近日山东第一医科大学焦建伟团队开发出一种用于检测circRNA的新方法——ihHCR系统。ihHCR系统不仅能够避免同源线性RNA的干扰，还能应用于体外定量和体内circRNA成像。
01.ihHCR简介
ih: hairpin
HCR: hybridization chain reaction
ihHCR：基于circRNA保守的BSJ序列和杂交反应链置换，双功能的ih探针能够结合circRNA并启动HCR
• ih探针包含circRNA互补片段与H1互补区域
• 两个发卡探针H1和H2通过ihHCR形成级联来放大信号
– H1用BHQ1和FAM染料标记，形成一个自淬灭探针（self-quenching probe），当发卡结构打开，荧光可以恢复。
– H2是一个连接器，当circRNA存在时，H1会结合到ih探针，这会触发H1和H2的级联杂交。
ih探针的识别区域(e*,d*)与circRNA的BSJ序列(e,d)杂交，使得ih探针结构打开将启动链(b*,a*)暴露出来；启动链(b*,a*)随后会与H1探针(a,b)结合破坏其发卡结构，从而恢复荧光信号；与此同时，ih探针的(c,b\)部分会暴露并与H2 (c*,b)杂交，并暴露(b*,a*);随后，H1和H2会不断地交替结合，从而产生一个非常大的杂交信号。
对于同源线性RNA，由于(e,d)序列很短，阻止了ih探针茎环结构的破坏，从而阻止了随后的HCR。这在很大程度上保证了circRNA检测的特异性。
02.ihHCR小试牛刀
• 通过凝胶电泳（PAGE, 图A）可以看出ihHCR产生了长的杂交链 —— 在lane4的顶端有一条明显的DNA条带，而在没有circRNA分子时，H1/H2、ih以及同源线性RNA所对应的lane2、lane3和lane5并没有出现明显的DNA条带。
• 同时，用原子力显微成像（AFM, 图D/E/F）更直观地展示了circRNA与ihHCR系统形成了长的DNA分子。
• 利用荧光分光光度法（fluorescence spectrophotometry ，图 B/C），基于H1探针信号参考，ihHCR系统包含circRNA的信号强度要显著高于不包含circRNA的；另外，同源线性RNA并不影响ihHCR系统检测的信号强度（蓝色和紫色信号）。
03.ihHCR敏感性检测
04.ihHCR特异性检测
• 序列的随机碱基突变用于检测ihHCR区分单碱基错配的能力
• miRNA-21作为模拟的随机序列
结果显示
• 不同浓度下，相比只有同源线性RNA的icHCR系统，包含circRNA的系统具有更高的荧光信号（图 A）
• 正常circRNA的信号强度是单碱基突变circRNA的2倍，是两个碱基突变的6倍；当miRNA-21加入，几乎没有信号显示（图B）
05.ihHCR细胞与组织检测
06.ihHCR活细胞成像
ihHCR优缺点一览
• 能直接检测复杂生物学样品的circRNA；
• 基于原位DNA自组装，该方法能够对细胞中低丰度的circRNA进行分析；
• 该方法也可以通过替换ih识别探针应用于其他非编码RNA。
当然，目前文章仅仅用ihHCR对circMTO1进行了检测，该系统是否能够检测其他circRNA还需要后续的试验进一步验证。
Jiao J, Wang G, Zou F, et al. Bifunctional probe-assisted hybridization chain reaction for circular RNA detection and live-cell imaging[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2022: 133145.
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