Cell Death Dis | circ_CEA抑制应激诱导的胃癌细胞凋亡的新机制

胃癌(GC)是最常见的癌症之一，全世界每年有100多万病例[1]。尽管其存活率在过去40年中显著增加，但GC仍然是2018年肿瘤死亡的第三大原因[2]。手术被认为是唯一根治胃癌的治疗策略，而化疗的加入可有效提高胃癌患者的存活率。然而，用于GC治疗的传统化疗药物，如阿霉素(Dox)，副作用严重，患者耐药性的产生也限制了其临床应用。因此，迫切需要研究胃癌的发病机制，为胃癌的诊断和治疗寻找新的靶点。

环状RNA(circRNA)是一组具有独特闭合环状结构的内源性RNA分子，在癌症的发生和发展中具有多种功能，例如作为microRNA(MiRNA)海绵的功能或作为蛋白质合成的模板。在之前的研究中，我们发现circAXIN1通过编码一种新的致癌蛋白AXIN1-295aa来促进GC的发展。此外，最近的研究报告了一些circRNA作为蛋白质支架来影响两个或更多蛋白质之间的相互作用。然而，circRNA作为蛋白质支架的确切机制以及circRNA的这种功能如何影响肿瘤的发生和GC的进展仍不清楚。

2022年9月27日，广东省基因组稳定性与疾病防治重点实验室Yin Peng在Cell Death and Disease上发表了一篇题为circ_CEA promotes the interaction between the p53 and cyclin-dependent kinases 1 as a scaffold to inhibit the apoptosis of gastric cancer的文章，在这篇文章中，作者揭示了circ_CEA通过作为蛋白质支架并与P53和CDK1蛋白相互作用，保护GC细胞免受应激诱导的凋亡。靶向circ_CEA与化疗药物联合治疗可增加肿瘤细胞的凋亡率，缩小肿瘤体积，减轻化疗药物的副作用。因此，针对GC治疗，靶向circ_CEA可能是一种新的策略。

1、数据库预测，获得目的circRNA

作者为了研究在GC中潜在的异常调节的circRNA，对5对GC和癌旁组织进行了高通量circRNA测序。共鉴定出478个调控异常的circRNA，表明这些circRNA可能参与了GC的发育。随后进一步分析了每对组织中circRNA的表达谱，以确定重叠的circRNA。circ_CEA(CircBase ID：HSA_CIRC_0051240)是唯一在所有五对GC组织中均显著上调的circRNA。因此，该circRNA被选中用于进一步研究。

2、circRNA表达研究

作者进一步检测了circ_CEA在GC组织中的表达水平。qPCR关于52例GC和相应的癌旁组织分析表明，circ_CEA在GC中显著上调。利用GSE152309的基因表达总集(GEO)数据库中的RNA-seq数据对circ_CEA和CEA之间的表达相关性进行了分析。结果显示，在10例胃组织中，circ_CEA与CEA呈正相关。综上所述，circ_CEA可能是影响GC总生存率的不良预后因素。此外，FISH结果显示，circ_CEA定位于细胞中的核和胞浆。

图1. circ_CEA在胃癌组织和细胞系中表达上调

3、circRNA表型研究

为了探讨circ_CEA在GC发展中的作用，作者构建circ_CEA的过表达和Simix敲低载体，在体外进行了功能分析。EDU分析显示，circ_CEA基因敲低显著抑制AGS细胞的增殖，而circ_CEA过表达促进增殖。此外，划痕实验和细胞迁移实验显示，敲低circ_CEA可显著减少细胞迁移，过表达circ_CEA则有相反的结果。此外，敲低circ_CEA可降低AGS细胞的克隆形成能力，而过表达circ_CEA亦有相反的结果。

为了研究circ_CEA在应激诱导的细胞凋亡中的作用，将过表达和敲低circ_CEA的AGS细胞置于血清饥饿中72小时，然后用Annexin V/PI染色通过流式细胞仪检测细胞凋亡。敲低circ_CEA可增加血清饥饿诱导的早期细胞凋亡，circ_CEA过表达则有相反的结果。

4、circ_CEA与P53和CDK1蛋白相互作用

接下来，作者研究了circ_CEA抑制应激诱导的GC细胞凋亡的机制。推测circ_CEA可能通过调控凋亡相关蛋白的表达或与这些蛋白相互作用而参与细胞凋亡。为了识别与circ_CEA相互作用的潜在蛋白质，我们进行了基于MS2/MS2-CP的RNA下拉试验。收集沉淀产物，进行蛋白质质谱分析。KEGG分析表明，这些蛋白质主要与内吞作用、剪接体、细胞周期和p53信号通路有关。

在这些蛋白中，与P53信号通路相关的P53和CDK1引起了人们的关注。P53在各种应激刺激下被激活，并通过诱导细胞凋亡而起到抑制肿瘤的作用。为了进一步证实circ_CEA是否与p53和CDK1蛋白相互作用，在293T和AGS细胞中进行了RIP检测。作者还研究了circ_CEA和FOXO_3之间的相互作用，FOXO_3是参与细胞应激反应和细胞凋亡的重要转录因子。在有或不有circ_CEA过表达的293T细胞中，抗P53抗体共沉淀了circ_CEA。在转染circ_CEA表达载体的293T细胞中，抗CDK1或FOXO_3抗体也可共沉淀。与293T细胞的研究结果一致，在转circ_CEA表达载体的AGS细胞中，抗P53、CDK1和FOXO_3抗体共沉淀了circ_CEA。进一步，利用生物素标记的针对circ_CEA连接位点的寡核苷酸探针，对293T细胞进行了CIRCCEA表达载体的RNA下拉检测。与对照探针相比，circ_CEA探针沉淀了更高水平的p-p53 ser315、p53、CDK1和FOX03蛋白。CDK1是Ser/Thr蛋白激酶家族中的一员，已被报道在Ser315处介导P53的磷酸化。进一步，用circ_CEA探针和抗P53抗体在AGS细胞中进行FISH分析，证实了circ_CEA和P53的共存。这些结果表明，circ_CEA与P53、CDK1和FOXO_3蛋白相互作用。

图2.circ_CEA抑制应激诱导GC细胞凋亡的机制探讨

5、circ_CEA促进CDK1介导的P53在Ser315位的磷酸化并抑制P53在胃癌中的活性

CDK1诱导的SER315处的P53磷酸化，降低了P53的稳定性并抑制了P53的功能。由于作者已经证明circ_CEA促进CDK1和P53蛋白之间的相互作用，接下来就研究了circ_CEA是否影响SER315处的P53磷酸化。用1.25μM的Dox处理siRNA转导的AGS细胞一段时间后，用Western blotting检测细胞中凋亡相关蛋白的表达。circ_CEA下调显著降低p-P53 ser315水平，但不影响总P53水平。

6、下调circ_CEA抑制体内肿瘤生长并促进细胞凋亡与胃癌肺转移的实验研究

为了研究circ_CEA对体内肿瘤生长的影响，我们将AGS细胞注射到BALB/c裸鼠体内，建立了皮下移植瘤模型。然后将这些小鼠随机分为4组：1.对照组、2.circ_CEA Simix敲低组、3.Dox组和4.Simix+Dox组。与对照组相比，circ_CEA Simix或Dox单独给药抑制肿瘤生长，而它们联合给药的抑制效果明显更明显。

qPCR分析证实，circ_CEA siRNA注射后，circ_CEA在体内的表达明显受到抑制。接下来，TUNEL分析显示，单独给予circ_CEA siRNA或Dox诱导皮下移植瘤中等程度的凋亡，而联合给予进一步促进凋亡。qPCR分析显示，circ_CEA Simix诱导P53促凋亡靶基因noxA、Puma、Fas、Bax和FOX03靶基因Bim显著上调。提示circ_CEA基因敲低可抑制肿瘤生长，促进细胞凋亡，其机制可能与体内调控P53靶基因表达有关。

与对照组相比，Dox或circ_CEA Simix单独给药显著减少了肺部转移灶，而联合给药对肺转移的抑制作用明显更大。此外，服用Dox或Dox+Simix的小鼠体重明显低于对照组或circ_CEA Simix组。对照组和circ_CEA Simix组小鼠体重无显著差异，表明circ_CEA Simix给药没有引起严重的副作用。在治疗癌症患者时，化疗毒性是一个主要问题。化疗药物与circ_CEA siRNA联合治疗可降低毒副作用，提高疗效。研究结果表明，circ_CEA下调可减少体内肺转移。联合应用circ_CEA、siRNA和Dox对肿瘤转移有协同抑制作用。

图3.circ_CEA抑制应激诱导GC细胞凋亡的机制

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41419-022-05254-1

参考文献：

[1]Rawla P, Barsouk A. Epidemiology of gastric cancer: global trends, risk factors and prevention. Prz Gastroenterol. 2019;14:26–38

[2]Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2018;68:394–424.

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