CRC（结直肠癌）作为最常见的恶性肿瘤之一，是癌症导致死亡的第二大因素[1]。虽然临床上-针对CRC患者治疗的方案不断更新迭代，但是CRC患者的总体生存率仍旧很低。L-OHP (奥沙利铂)是一种抑制基因转录和DNA合成的第三代铂化合物，常用于CRC患者手术切除后的化疗方案中。然而，癌细胞最终形成的化学作用可通过多种机制阻碍L-OHP的有效性，包括药物吸收减少和药物失活等。因此，必须明确CRC细胞对L-OHP产生耐药性的精确分子机制，识别有效的生物标记物来分析L-OHP反应，并开发靶向治疗以减少耐药性。
越来越多的研究表示，外泌体中的非编码RNA和蛋白对参与肿瘤侵袭、增殖、免疫逃逸和耐药的靶细胞起作用，尤其是circRNA（环状RNA）。最近的一些研究已经报道了circRNA实际上可以编码蛋白质。并且外泌体富集的circRNA在CRC化疗耐药中的功能和潜在机制备受关注，并需要进一步研究。
近期，广东省人民医院胃肠外科主治医师李勇在Advanced Science上发表文章：A Novel Protein Encoded by Exosomal CircATG4B Induces Oxaliplatin Resistance in Colorectal Cancer by Promoting Autophagy。文章表示：L-OHP虽常用于结直肠癌手术切除后的化疗方案，但是其耐药性的出现会影响CRC患者的疗效。而circATG4B是L-OHP耐药发生的关键。机制在于，circATG4B可编码一种新的蛋白质（circATG4B-222aa）与TMED10互作，阻止TMED10与ATG4B结合，从而导致自噬增加，继而诱导L-OHP耐药。研究揭示了外泌体circATG4B参与了CRC细胞化疗敏感性的降低，为潜在的治疗CRCL-OHP 耐药靶点提供了新的理论基础。
1.L-OHP耐药CRC中ATG4B相关circRNA的分析
ATG4B在各种癌症中的自噬诱导功能，已被报道与化疗耐药有关[2]。因此，作者在circBase找到15个ATG4B，并从中发现circATG4B(hsa_circ_0007159)在L-OHP 耐药患者的CRC组织以及耐药CRC细胞系中明显上调。背靠背引物验证/R酶处理/FISH验证circATG4B成环/稳定/定位胞质。这些结果表明circATG4B稳定存在，并与CRC患者的L-OHP 反应密切相关。
图1. circATG4B的特性
2.来自外泌体的circATG4B诱导CRC细胞耐药性
以前的研究已经证明，circRNA可以包装成外泌体，并可以进行细胞间转移。因此，我们假设从L-OHP 耐药的CRC细胞分离出的外泌体circATG4B可转移到L-OHP 敏感细胞，导致细胞产生耐药性。为了验证这一假设，从L-OHP 耐药CRC细胞上清液中分离出的外泌体，电镜/NTA/WB观察其双层膜的结构/前体大小分布/外泌体标记物的表达，且circATG4B在外泌体中含量丰富；然后发现，该外泌体可侵染正常CRC细胞。此外，体外细胞实验+体内表示，外泌体circATG4B降低了CRC患者对L-OHP 的敏感性；而敲低circATG4B则有相反的结果。
图2. 外泌体的circATG4B诱导CRC细胞耐药性
3.外泌体circATG4B增强L-OHP 耐药过程中的自噬活性
根据以往的研究，自噬在药物耐药过程中起着重要作用。作者发现自噬诱导剂——雷帕霉素可诱导CRC细胞耐药，自噬抑制剂——3-甲基腺嘌呤增加CRC细胞耐药；L-OHP 会增加CRC细胞自噬水平，进而诱导CRC细胞耐药。而同时外泌体circATG4B可诱导CRC细胞L-OHP 耐药，作者推测自噬介导了该作用。过表达circATG4B增强CRC细胞耐药性，然而，3-甲基腺嘌呤治疗逆转了这一作用，表明circATG4B可以通过自噬诱导耐药。此外，透射电镜(TEM)分析显示，exo-si-NC预处理后自噬体数量增加，而exo-si-circATG4B预处理后自噬体数量显著减少(图3G)。进一步证实了外泌体circATG4B通过调节自噬诱导CRCL-OHP 耐药。
图3. 外泌体circATG4B促进细胞自噬
4.circATG4B编码一种新的蛋白-circATG4B-222aa诱导细胞L-OHP耐药
MicroRNA (miRNA)海绵作用是circRNA最常见的功能。然而，RIP结果显示circATG4B与AGO2无关，这表明circATG4B可能通过不同的机制发挥其功能。越来越多的证据表明，一些circRNA能够编码新的蛋白质。通过查阅circRNA Db发现，circATG4B有一个669nt的ORF，有可能编码222个氨基酸的蛋白质，并且其中有一段包含33个氨基酸的新序列。作者在ORF中发现534nt-672nt处有一个IRES，并用双荧光素酶法验证了circATG4B中IRES具有活性。随后，作者构造了四个不同的载体(阴性空载对照/带Flag标签载体/突变起始密码子+Flag标签阴性载体对照/线性阳性载体对照)，又研发了一种新的抗体（特异识别circATG4B-222aa），用qPCR和WB证实circATG4B-222aa能够被翻译出来。最后，通过SDS-PAGE分离转染了circATG4B细胞的总蛋白，然后将大小接近24kd的蛋白条带切除并提交质谱分析，发现了circATG4B的剪接位点处所形成的独特肽序列(IAELDPSIAVIGGGHKG)，表明circATG4B可以编码一种新的蛋白质。此外，在接受L-OHP 治疗的CRC患者中，circATG4B-222aa表达与不良预后呈正相关，这提示circATG4B-222aa可能是L-OHP 耐药细胞的预后标志物。
图4. circATG4B编码CircATG4B-222aa
作者通过将上述4种载体体外转染到CRC细胞中发现，仅转染circATG4B或circATG4B-222aa过表达载体后，自噬增加，CRC细胞耐药性增加；另外，作者又在体内小鼠中做皮下注射稳转四种载体细胞，结果同体外实验相同。这些结果表明，能够编码circATG4B-222aa的载体才可增加自噬水平，诱导细胞L-OHP 耐药。
图5.完整的circATG4B才可增加自噬水平，诱导细胞L-OHP耐药
5.circATG4B-222aa与TMED10蛋白互作，释放ATG4B
为了进一步探索circATG4B-222aa在自噬中的潜在机制。作者CO-IP/MS/IF检测circATG4B-222aa互作蛋白发现并验证了TMED10，并且二者定位于胞质。为了探索TMED10与circATG4B-222aa相互作用的区域，作者构建了一系列GFP标记的TMED10删除突变体。并通过Co-IP/WB实验验证，TMED10的TD和CD都是TMED10与circATG4B-222aa相互作用的必要条件。
通过与标记了circATG4B-222aa的截断突变体相互Co-IP分析，我们还确定了circATG4B-222aa与TMED10相互作用相关的区域。circATG4B-222aa (aa 1-111)和circATG4B-222aa (aa 112-222)都可以被TMED10拉下，表明无论是整段circATG4B-222aa还是前半段和后半段都可以与TMED10相互作用。但是在进一步的研究中，结果显示，只有全长的circATG4B-222aa可增加自噬过程。
由于circATG4B-222aa除了独特的氨基酸外，其大部分氨基酸序列与线性基因ATG4B相同，作者推测circATG4B-222aa可能通过结合TMED10，释放ATG4B。随后CO-IP结果发现，circATG4B-222aa过表达削弱了TMED10和ATG4B之间的相互作用，这表明circATG4B-222aa可结合TMED10，释放ATG4B。综上所述，这些发现表明circATG4B-222aa可能作为TMED10的诱饵，从而释放TMED10抑制的ATG4B。
图6.circATG4B-222aa与TMED10蛋白互作，释放ATG4B
6.circATG4B-222aa逆转TMED10诱导的L-OHP耐药CRC细胞的化疗敏感性
随后，作者评估了circATG4B-222aa和TMED10之间的相互作用在L-OHP 耐药细胞中的作用。体外实验发现，circATG4B-222aa可逆转了TMED10在耐药CRC细胞中诱导的凋亡和化疗敏感性的增加；体内实验发现，在植入过表达TMED10的细胞组中，肿瘤生长和体重均显著下降，而过表达circATG4B-222aa则逆转了这种抑瘤作用。总之，这些结果表明circATG4B-222aa可以拮抗TMED10作用，诱导细胞L-OHP耐药。
图7.circATG4B-222aa拮抗TMED10作用，诱导细胞L-OHP耐药
原文链接：
https://doi.org/10.1002/advs.202204513
参考文献：
H. Sung, J. Ferlay, R. L. Siegel, M. Laversanne, I. Soerjomataram, A.Jemal, F. Bray, CA Cancer J. Clin. 2021, 71, 209.
A. Agrotis, R. Ketteler, Cells 2020, 9, 53.
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