在中国，原发性肝癌发病率居第4位、死亡率高居第2位。肝癌的主要组织学类型是肝细胞癌（HCC），占原发性肝癌的75-85%，治疗肝癌的临床一线药物索拉非尼等，虽可一定程度提高晚期HCC患者的生存率，然而缺乏灵敏的诊断标记物和肝癌耐药是临床诊疗中亟待解决的问题。近几年，虽然环状RNA（circRNA）被大量发现，但仅有极小部分circRNA具有癌症诊断标志物及治疗靶点的潜力。
circRNA是高稳定性的一类非编码RNA，在多种疾病尤其是癌症的进展中发挥着重要作用。然而，其在HCC发生和转移及耐药中的潜在机制仍不完全清楚。研究发现源自ZKSCAN基因的circZKSCAN1在HCC病人组织中表达显著降低。circZKSCAN可能是HCC发生发展过程的关键因子，可能作为HCC诊断和治疗的新生物标志物或靶点。探究其在HCC中的机制能为HCC患者的诊治提供新思路。
2023年2月1日，中国农业大学生物学院李向东教授课题组在Molecular Cancer（IF=41.444）发表了题为“A novel polypeptide encoded by the circular RNA ZKSCAN1 suppresses HCC via degradation of mTOR”的文章。在此文中，通过分析HCC的circRNA测序数据库，选择了circZKSCAN1进行了深入研究。通过质谱、多糖体分级分析、双荧光素酶报告等实验表明，circZKSCAN1编码一个新多肽-circZKSaa。通过免疫沉淀、质谱和免疫荧光染色等分析验证了多肽circZKSaa和mTOR间的关系。最终表明，新的circZKSCAN1编码肽在PI3K/AKT /mTOR通路上起抑制肿瘤的作用，并通过介导mTOR的泛素化使HCC细胞对肝癌一线药物索拉非尼敏感；该circZKSaa具有作为HCC治疗靶点和临床生物标志物的潜力。
绝大多数的研究报道，circRNAs作为“miRNA海绵”行使其功能。有趣的是，该研究证明circZKSCAN1无miRNA海绵功能，而是翻译为新肽（circZKSaa），该多肽可增加HCC细胞对肝癌一线药物索拉非尼的敏感性。circZKSaa通过与FBXW7互作促进mTOR泛素化，最终抑制HCC细胞增殖。
01、circZKSCAN1在HCC组织中下调，对索拉非尼治疗敏感
为确定HCC差异表达的circRNA，研究者分析了HCC的circRNA谱数据，获得5种差异表达circRNA。使用30对临床组织（HCC vs.正常）及HCC细胞系（SNU-387、Hep3B、Huh-7、HCC-LM3和SNU-398 vs.正常THL-2）检测了这5种circRNA的表达。基于GEO数据库中索拉非尼耐药性HCC患者的数据和生物信息学分析，最终确定了circZKSCAN1。研究提示了circZKSCAN1在HCC进展和治疗中起重要作用。
图1.circZKSCAN1在肝细胞癌病人中表达下调
02、circZKSCAN1编码一个206 氨基酸（aa）的多肽
作者通过RIP实验观察到在AGO2沉淀中circZKSCAN1无富集，推测circZKSCAN1在HCC中无“miRNA海绵”的作用。通过克隆了串联的Renilla Luciferase Luciferasse（Rluc–Luc）间的两个IRSE位点（IRSE-1和IRSE-2），测量了Luc相对于RLuc的荧光素酶活性。结果表明IRSE-1和IRSE-2都可诱导核糖体进入，提示了circZKSCAN1 具有翻译潜能。进一步发现circZKSCAN1几乎在HCC-LM3多聚核糖体的所有部分中都存在。通过过表达circZKSCAN1和多肽-circZKSaa，过表达circZKSCAN1 mut（突变体）实验及检测了circZKSaa在正常肝脏和HCC中的表达，研究发现circZKSCAN1在HCC细胞中编码一个206aa的新多肽。
图2.circZKSCAN1编码一个 206aa的新多肽
通过对比来自12对组织（HCC肿瘤vs.配对的正常组织）中circZKSaa的表达，发现circZKSaa在肿瘤中显著降低。对29 对HCC患者组织的circZKSaa受试者工作曲线（ROC）分析表明，ROC线下面积（AUC）显示其诊断特异性为100%。研究发现circZKSaa在circZSKaa转染的HCC-LM3和293 T细胞的上清液中分泌；且circZKSCAN1在HCC患者血清中低表达，表明了circZKSCAN1和/或多肽circZKSaa作为HCC患者的生物标志物的潜能。进一步结果表明，索拉非尼处理48小时后，circZKSaa的表达以剂量和时间依赖的方式增加， circZKSaa肽可增强索拉非尼在HCC细胞中的抗肿瘤作用。
图3.circRNA编码肽-circZKSaa具有临床诊断价值
研究者构建了一系列稳定的细胞系，如线性circZKSaa过表达细胞、circ-ZKSCAN1过表达细胞，突变circZKSaa起始密码子细胞（circZKSCAN1 mut）、下调细胞（sh-circZKSCAN1），以及各自的对照细胞（sh scramble和Vector）。通过RT-PCR和Western Blot实验证明了circZKSaa可抑制细胞周期。
图4. circRNA编码肽-circZKSCaa抑制HCC细胞生长
为了进一步探讨circZKSaa在体内的作用，将稳定过表达的circZKSaa和circZKSCAN1 mut HCC细胞系皮下注射到裸鼠中。观察到，circZKSaa过表达组中的肿瘤体积较小，而circZKSCAN1 mut中肿瘤与对照组相同；circZKSaa敲除组的肿瘤更大。动物研究表明，circZKSaa抑制HCC细胞的增殖并促进细胞凋亡，表明circRNA编码肽-circZKSCaa具有HCC治疗靶点的潜能。
图5.circRNA编码肽-circZKSCaa通过促进细胞凋亡抑制裸鼠中HCC生长
06、circZKSaa通过抑制mTOR磷酸化防止AKT激活
研究者检查了HCC肿瘤发生的关键参数，如磷酸-ERK1/2（Thr202/Tyr204）、β-catenin和p-AKT-ser473。发现p-AKT-ser473显著下调，而p-AKT-thr308无明显变化。检查了mTOR或PDK1与circZKSaa互作的潜力。结果显示，在mTOR抗体介导的沉淀中可检测到circZKSaa,且circZKSaa与mTOR共定位。进一步发现circZKSaa过表达使S6K1和MDM2的磷酸化失活，证实了circZKSaa分别抑制AKT和mTOR的下游途径抑制HCC肿瘤。
图6.circRNA编码肽circZKSCaa通过抑制AKT和mTOR下游信号抑制HCC
07、circZKSCaa通过与FBXW7相互作用降解mTOR
通过抑制HCC细胞中新的蛋白质合成和蛋白酶体抑制实验、 Co-IP测定等一系列实验，研究表明circZKSaa和FBXW7可以相作。免疫荧光染色显示，circZKSaa与FBXW7在HCC细胞中共定位。结果表明，circZKSaa可能通过FBXW7蛋白影响mTOR蛋白的泛素化水平。通过一系列实验表明，当circZKSaa在细胞中过表达时，FBXW7与mTOR的结合增加。免疫沉淀和免疫荧光实验表明，circZKSaa可通过Fbw7介导与mTOR的631和635区域与相互作用。
图7.编码肽circZKSCaa通过促进mTOR的泛素化抑制AKT通路抑制HCC
小结：研究表明，circZKSCAN1编码一种新的多肽-circZKSaa，该多肽通过与FBXW7结合，介导mTOR的泛素化降解，进而抑制HCC细胞的增殖；此外该多肽还增加了HCC细胞对一线药物索拉非尼的敏感性。因此，circZKSaa是一种潜在的临床生物标志物和HCC的治疗靶点。
原文链接：
https://doi.org/10.1186/s12943-023-01719-9
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