IF17.694 | circRNA充当调节因子，为肥胖人群预防糖尿病提供潜在策略

糖尿病是一种在全球范围内迅速增长的疾病，对人类健康有重大威胁[1]。其中，2型糖尿病（T2DM）是糖尿病的主要形式，而在我国T2DM占所有糖尿病病例的90%以上。肥胖常常是T2DM的主要危险因素，T2DM从代偿性胰岛素抵抗进展为胰岛β细胞衰竭[2]，最终导致无代偿性的高血糖。由于胰岛β细胞凋亡的具体原因及其在代偿期的预防机制尚不清楚，因此，探究肥胖后β细胞凋亡和功能障碍的具体分子机制，对于我国广大糖尿病高危人群预防肥胖引发的T2DM具有重要意义。

circRNA作为一种新型的非编码RNA分子，参与了多种疾病的进展过程。先前研究表明胰岛中有数千种胰岛特异性circRNA，也有部分研究为了解circRNA在胰岛β细胞中的功能提供了重要基础[3]，但目前尚不清楚这些circRNA如何导致肥胖介导的β细胞功能障碍和凋亡。circGlis3是一种富含在胰岛中的circRNA，在遗传和饮食肥胖小鼠模型的胰岛中上调，而这种表达增加会导致胰岛素分泌增强、β细胞凋亡减轻。因此，探究circRNA在胰岛中的具体机制，可以为预防糖尿病提供新思路和新策略。

2023年1月21日，中国药科大学生命科学与技术学院张方方副研究员团队在Nature Communications（IF=17.694）发表文章：Circular RNA circGlis3 protects against islet β-cell dysfunction and apoptosis in obesity。在本文中，作者发现了肥胖小鼠胰岛和肥胖人群血清中circGlis3的异常高表达并增强了胰岛素分泌。机制上，circGlis3通过吸收miR-124-3p上调NeuroD1和Creb1促进胰岛素分泌，并通过与促凋亡因子SCOTIN相互作用减少细胞凋亡。RNA结合蛋白FUS招募circGlis3，并共同组装异常的细胞质应激颗粒（SG）以响应细胞应激。这项研究强调了circRNA在β细胞补偿中的生理作用，并表明circGlis3表达的调节可能是预防肥胖后因β细胞功能障碍和凋亡引发糖尿病的潜在策略。

1.circGlis3在肥胖雄性小鼠的胰岛中表达升高

作者对三种小鼠模型进行了circRNA表达谱分析，结合先前研究中对胰岛中circRNA的检测信息，经过分析比较和RT-PCR验证，作者选择circGlis3进行下一步研究。作者通过对小鼠胰岛中circGlis3表达的测量，发现当发生胰岛素抵抗时circGlis3的表达增加，肥胖小鼠的胰岛和其他组织中circGlis3的表达水平也均有所增加。经过一系列动物实验，作者发现糖耐量在肥胖饮食和遗传小鼠模型中，患有糖耐量受损（IGT）或T2DM的个体中，他们体内circGlis3的水平增加。

图1. circGlis3在肥胖中上调并与肥胖相关

2.剪接因子QKI调节circGlis3的形成

作者使用Sanger测序、琼脂糖凝胶电泳、RNase处理、RT-PCR、原位杂交等手段对circGlis3进行基础分析，证实了circGlis3存在反向剪接且为环状并通常位于细胞质中。作者检测剪接因子的表达水平，发现肥胖小鼠的剪接因子QKI在mRNA和蛋白质水平上都有所增加，并且mRNA与circGlis3的表达水平呈正相关。RT-PCR分析证实了QKI异位表达对circGlis3产生影响。作者通过RIP、RT-PCR、RNA pull down实验等操作证实了QKI与Glis3基因中形成circRNA的外显子3上下游结合，促进circGlis3的生成。

图2. 鉴定和剪接因子QKI调节circGlis3的形成

3. circGlis3的上调促进胰岛素转录并减轻体外β细胞凋亡

作者使用sh-circGlis3、sh-NC、oe-circGlis3质粒在β细胞进行过表达/敲除实验，发现过表达circGlis3能够显著增加胰岛素的表达。而在高糖环境下的实验结果显示抑制circGlis3的表达会减少胰岛素的分泌，但不影响胰高血糖素和生长抑素的分泌。作者又检测了多种转录因子的mRNA，证实了胰岛素增加过程与转录相关。作者使用CCK8、Ki67免疫荧光染色、western blot、TUNEL分析等实验方法发现，下调circGlis3促进cleaved-caspase3和BAX的表达、抑制BCL2的表达；上调circGlis3会抑制肥胖诱导的β-细胞凋亡。综上所述，circGlis3的上调可以减轻肥胖期间的β细胞凋亡。

图3. circGlis3的上调促进胰岛素转录和分泌，并抑制体外β细胞凋亡

4.circGlis3的过表达对体内β细胞功能障碍和凋亡的保护作用

作者通过直接向小鼠注射过表达腺病毒载体进行后续研究。结果显示，小鼠胰岛素抵抗指数的稳态模型评估（HOMA-IR）和胰岛素原与胰岛素比值显著降低。结果还显示，circGlis3过表达提高了葡萄糖耐量和胰岛素敏感性，并增强了胰岛素的分泌。作者分离胰岛进行后续研究，使用胰腺切片的形态计量学分析，发现过表达处理小鼠的β细胞质量比对照小鼠高1.7倍。circGlis3的上调导致裂解的Caspase3和BAX表达显著降低，同时增加BCL2表达。作者使用相同的方法对另一模型小鼠进行研究，结果表明饮食和遗传肥胖小鼠模型中circGlis3的过表达可改善β细胞功能，同时抑制β细胞凋亡，证实circGlis3对葡萄糖稳态的影响是β细胞介导的。

图4. circGlis3的过表达对体内β细胞功能障碍和凋亡的保护作用

5.circGlis3通过吸收miR-124-3p调节胰岛素转录

作者使用四种数据库进行原位分析，预测了四种miRNA可能是circGlis3的靶点，接着在实验动物中检测上述miRNA，并通过生物素标记、RT-PCR、RNA pull down、RNA原位杂交等手段证实了miR-124-3p覆盖内源性circGlis3，与circGlis3高度富集且在细胞质内共定位。作者运用双荧光素酶报告实验、RT-PCR和调节circGlis3的表达证实了circGlis3能作为miR-124-3p的分子海绵。作者进行的rescue实验结果表明，miR-124-3p过度表达导致的胰岛素转录减少部分被circGlis3过表达所逆转，而其介导胰岛素分泌抑制也能被circGLis3过表达消除。最后作者结合荧光素酶报告分析结果，发现circGlis3作为miR-124-3p的海绵，可上调NeuroD1和Creb1的表达，从而促进胰岛素的转录和分泌。

图5. circGlis3通过靶向和吸收miR-124-3p调节胰岛素转录

6.circGlis3与SCOTIN相互作用防止β细胞凋亡

作者通过使用体外转录和环化反应的测定制备了生物素化circGlis3，将其pull down后进行质谱分析，得到SCOTIN和FUS可能与circGlis3直接结合发挥RNA结合蛋白作用。SCOTIN是一种促凋亡因子，在DNA损伤或细胞压力时以依赖于Caspase的方式被激活。作者通过RIP实验、生物素标记、western blot、免疫荧光染色和动物实验等方法，证实了circGlis3与SCOTIN的相互作用。rescue实验表明circGlis3上调能够消除SCOTIN导致的细胞凋亡增加。作者还进行了SCOTIN过表达的rescue实验。这些结果表明，circGlis3通过与SCOTIN相互作用并抑制Caspase3的活性，在肥胖期间以Caspase依赖的方式防止β细胞凋亡。

图6. circGlis3通过直接结合SCOTIN防止β细胞凋亡

7.FUS隔离circGlis3以减少其在糖尿病中的丰度

FUS是一种70 kD的RNA结合蛋白，具有多种功能，可在应激反应中穿梭于细胞核和细胞质之间。作者使用RNA pull down和质谱分析，发现生物素标记的circGlis3 pulldown能够富集到FUS，而在动物实验中FUS的表达几乎没有增加。作者运用RIP实验和western blotting，发现FUS直接与circGlis3结合。一系列竞争抑制实验结果表明FUS过表达可能会逆转circGlis3对miR-124-3p的抑制作用，还可以竞争性抑制SCOTIN对circGlis3的富集。SCOTIN过表达后，FUS与circGis3的结合也减少。作者又对circGlis3和FUS染色，随后又进行可减少细胞应激颗粒（SG）组装的药物emetine干预和RT-PCR，结果表明，在糖尿病的发展过程中，FUS与miR-124-3p和SCOTIN竞争以结合circGls3，通过FUS形成的SG的募集功能限制细胞质中的扩散，导致circGlis3的减少。

图7. FUS通过组装胞质SG来隔离circGlis3以降低其在糖尿病中的丰度

小结

这项研究成果表明：circGlis3在肥胖相关β细胞功能障碍的发展中起着关键作用。circGlis3的过表达上调了胰岛素的转录和分泌，改善了异常的葡萄糖耐量和β细胞凋亡，circGlis3的增加将成为T2DM的诊断和治疗靶点，为circRNA在糖尿病中的调节功能带来新的思路，为预防肥胖诱因的糖尿病提供策略。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41467-023-35998-z

参考文献：

1. Bennett, J. E. et al. NCD Countdown 2030: worldwide trends in non-communicable disease mortality and progress towards Sustainable Development Goal target 3.4. The Lancet 392, 1072–1088 (2018).

2. Butler, A. E., Janson, J., Soeller, W. C. & Butler, P. C. Increased ␤-Cell Apoptosis Prevents Adaptive Increase in ␤-Cell Mass in Mouse Model of Type 2 Diabetes. 52, (2003).

3. Stoll, L. et al. Circular RNAs as novel regulators of β-cell functions in normal and disease conditions. Mol. Metab. 9, 69–83 (2018).

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