内皮细胞（EC）是排列在血管内表面具有保护屏障作用的细胞，其功能包括维持血管内稳态、调节血压、促进血管生成和控制凝血过程。与人体的其他正常二倍体细胞相同，血管内皮细胞的寿命是有限的，随着分裂次数的增加，最终进入复制性衰老状态。血管内皮细胞衰老会导致内皮功能障碍，内皮功能障碍是动脉粥样硬化和高血压的独立危险因素。因此，阐明血管内皮细胞衰老的潜在分子机制，对与老年性心血管疾病的防治具有重要意义。

环状RNA(circRNAs)是一种由反向剪接形成的的内源性RNA分子。环状内含子RNA（ciRNAs）是环状RNA的其中一类，是由内含子套索前体逃避典型线性剪接的去分支步骤而产生的。circRNA参与各种生理和病理生理过程的调节，然而circRNAs在血管内皮细胞衰老中的作用尚不清楚。研究发现，一种名为ciPVT1的新型环状内含子RNA在血管内皮细胞衰老过程中差异表达，并且ciPVT1可以抑制血管内皮细胞的衰老，并增加血管生成活性。这些发现表明ciPVT1是血管内皮细胞衰老的重要调节因子。

广东医科大学衰老研究所熊兴东教授在Aging Cell（IF=11.005）上发表了题为A circular intronic RNA ciPVT1 delays endothelial cell senescence by regulating the miR-24-3p/CDK4/pRb axis的文章。在本项研究中作者发现并鉴定了一种起源于PVT1基因内含子4的环状内含子RNA：ciPVT1，其在衰老的血管内皮细胞中的表达显著减少。进一步的功能和机制研究表明，ciPVT1可能通过海绵miR-24-3p作为竞争内源性RNA（）(ceRNAs)来调节CDK4及其下游基因，进而延缓血管内皮细胞衰老。本文的研究结果揭示了circRNA参与血管内皮细胞衰老的具体分子机制，为预防和治疗年龄相关的心血管疾病提供新的思路。

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内皮细胞中ciPVT1的鉴定及特性

作者对RNA-seq数据进行分析发现ciPVT1在两种衰老的血管内皮细胞中均显著下调，提示ciPVT1可能在血管内皮细胞衰老中发挥作用。然后，作者通过RT-qPCR、western blot、建立细胞模型等方法，验证了血管内皮细胞中ciPVT1的表达下调并与细胞衰老相关。随后作者使用Sanger测序、RNase处理等证实了ciPVT1的来源和特性。以上的结果表明ciPVT1是一个位于PVT1内含子4、具有环状结构且相对稳定的转录本，在衰老的血管内皮细胞中显著下调。

图1. 血管内皮细胞中ciPVT1的表达及特性

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ciPVT1延缓内皮细胞衰老，促进

内皮细胞增殖和血管生成能力

作者通过设计siRNA探究ciPVT1在内皮细胞衰老中的作用。实验结果显示，ciPVT1的沉默和表达下调，能够导致细胞形态学改变，并伴有SA-β-gal活性的增加，影响力内皮细胞形成毛细血管网络的能力。作者又研究了内皮细胞的体内血管生成活性，发现si-ciPVT1组显示较少的心血管形成。HE染色和IHC的结果表明了si-ciPVT1组血管样结果减少。细胞周期分析发现si-ciPVT1组S期细胞数量减少，G1期数量增加。而过表达ciPVT1则延迟了内皮细胞的衰老。这些结果表明ciPVT1参与内皮细胞衰老表型的调节。

图2. 沉默ciPVT1基因可促进内皮细胞衰老、抑制细胞增殖和血管生成

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ciPVT1可作为miR-24-3p的海绵

作者使用RT-qPCR实验，证实了ciPVT1主要位于细胞质中。然后，运用生物素标记和RIP实验来探究能与其互相作用的miRNA，发现miR-24-3p具有最高的富集度。作者接着运用RNA杂交和双荧光素酶报告实验证实了ciPVT1与miR-24-3p的直接作用。随后，作者进行了RNApull-down和RNA FISH分析进一步证实了二者的相互作用。作者定量分析了血管内皮细胞中ciPVT1和miR-24-3p的绝对拷贝数，结果表明，两者的拷贝数相当。此外还发现，ciPVT1和miR-24-3b并不会被彼此促进降解。总之，以上结果充分证明ciPVT1可作为miR-24-3p的海绵发挥功能。

图3. ciPVT1充当miR-24-3P的海绵

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miR-24-3p促进内皮细胞衰老、抑制

增殖、损害毛细血管网络形成能力

作者探讨miR-24-3p在血管内皮细胞衰老中的作用。结果显示，过表达miR-24-3p可增加SA-β-gal阳性细胞的数量，抑制细胞增殖和内皮细胞的小管形成能力，证实了miR-24-3p在内皮细胞衰老中的关键作用。CDK4是细胞周期G1期过渡的关键调节因子。western blot实验结果表明过表达miR-24-3p减少了内皮细胞CDK4和磷酸化Rb(pRb)蛋白的水平，而miR-24-3p的过表达或抑制并未改变Rb的表达水平。这些结果表明miR-24-3p可以通过CDK4/pRb途径诱导内皮细胞衰老，抑制细胞增殖，并损害内皮细胞的小管形成能力。

图4.miR-24-3p促进内皮细胞衰老，抑制增殖，损害内皮细胞小管形成能力

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过表达ciPVT1减轻

miR-24-3p诱导的内皮细胞衰老

作者运用SA-β-gal染色、过表达、设计rescue实验等方式研究了ciPVT1是否通过与miR-24-3p相互作用而延缓衰老、促进细胞增殖和增加血管生成活性。结果显示miR-24-3p可促进内皮细胞衰老，其作用可被ciPVT1的过表达所阻断。miR-24-3P可降低内皮细胞的成管能力，抑制细胞增殖。同样，ciPVT1的过表达可以挽救miR-24-3p过表达所诱导的这些表型。这些结果表明ciPVT1通过吸附miR-24-3p延缓血管内皮细胞衰老。

图5. 过表达ciPVT1可减轻miR-24-3p诱导的内皮细胞衰老

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ciPVT1通过调节miR-24-3p/

CDK4/pRb轴延缓内皮细胞衰老

作者发现ciPVT1过表达后CDK4/pRb的表达上调，敲低则反之；作者还观察到外源miR-24-3p可以显著抑制CDK4的表达，并且在ciPVT1过表达后抑制被延迟。随后作者又对miR-24-3p上与ciPVT1结合的位点进行突变，发现缺乏结合miR-24-3p能力的突变体ciPVT1的过表达对细胞衰老、增殖、内皮细胞的血管生成活性和CDK4/pRb水平没有影响，这表明ciPVT1充当miR-24-3p的海绵，通过内皮细胞中的ceRNA机制调节CDK4，作者对老年人动脉中的检测结果证实了这一点。综上所述，ciPVT1通过miR-24-3p/CDK4/pRb途径延缓了内皮细胞的衰老、促进细胞增殖并增加了血管生成能力。

图6. ciPVT1通过调节miR-24-3p/CDK4/pRb轴

延缓血管内皮细胞衰老

结论

该项研究对源自PVT1基因内含子4的ciRNA进行了表征和功能分析。证明了ciPVT1在衰老的内皮细胞中下调，并首次阐明了环状内含子RNA在血管内皮细胞中的分子机制：ciPVT1通过靶向miR-24-3p/CDK4/pRb途径延缓血管内皮细胞衰老。该项研究的成果表明了ciPVT1可以作为延缓内皮细胞衰老及防治相关的血管并发症的分子靶点。

原文链接：

https://doi.org/10.1111/acel.13529

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分类： circRNA功能验证, 功能机制, 心血管疾病, 最新重要进展, 研究热点跟踪评论

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