Mol cancer丨中山大学孙逸仙纪念医院姚婷婷/钟广雷团队揭示环状RNA促进宫颈癌转移

尽管宫颈癌筛查和HPV疫苗已被广泛使用，但由于宫颈癌的转移性，仍是全球女性癌症发病率和死亡率的第四大疾病。转移是一个复杂变化且相互作用的过程。TGF-β是与多种癌细胞转移相关的多功能细胞因子，但其涉及宫颈癌的潜在机制尚未完全了解。 N6-甲基腺苷（m⁶A）是信使RNA（mRNA）中最常见的修饰物。胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白（IGF2BPs）被认为是m⁶A的阅读器，它可以通过识别一致的GG（m⁶A）C序列来靶向数千个mRNA转录本。IGF2BPs属于一个保守的RNA结合癌胎蛋白家族，可以影响极化、迁移、形态、代谢、增殖和分化。CDR1as是一种长度为1485bp的传统环状RNA。它位于X染色体上，直接转录自LINC000632。然而，CDR1在宫颈癌中的作用尚未被明确。

2023年3月31日，中山大学孙逸仙纪念医院肿瘤科姚婷婷/钟广雷团队在Molecular Cancer（IF=41.444）发表文章TGF-β signaling promotes cervical cancer metastasis via CDR1as。作者发现TGF-β通路与宫颈癌的转移有关。研究发现在TGF-β激活后，CDR1的表达明显上调，CDR1与淋巴结转移和生存时间缩短呈正相关。同时，CDR1的过表达促进了宫颈癌的体内外转移。作者还发现，CDR1as可以促进IGF2BP1对SLUG mRNA的调控，并稳定其不被降解，而沉默IGF2BP1则会阻碍CDR1在宫颈癌中的相关转移。此外，有效的CDR1as可以激活促进EMT的TGF-β信号因子。研究证实了TGF-β信号通路通过CDR1as促进宫颈癌的转移。

宫颈癌细胞中诱导TGF-β后，CDR1的表达显著上调

首先，作者通过TGF-β诱导子宫颈癌细胞的EMT，发现6964个环状RNA表达上调，6596个表达下调。于是选择变化最明显50个环状RNA进行RT-PCR检测，发现CDR1的倍数变化最大，猜测CDR1as可能参与了TGF-β通路诱导的宫颈癌转移。

图1 TGF-β诱导子宫颈癌细胞的EMT

CDR1预示着淋巴结转移和更差的总生存率

接着作者对CDR1进行研究，FISH和核-质分离实验结果显示，CDR1as主要位于细胞质，可能在转录后发挥作用。进一步整理其与临床参数的关系，发现CDR1在淋巴结转移中表达较高，与较短的总生存期和较差的预后相关。然而，CDR1as与肿瘤分级、分期和原发肿瘤体积之间没有显著的相关性。

图2 CDR1预示淋巴结转移和总生存期差

图3 CDR1与临床病理因素相似

CDR1as可能促进子宫颈癌细胞的转移

于是，作者继续探究CDR1as对子宫颈癌细胞的转移的影响。癌细胞中CDR1过表达后，Transwell实验显示，与对照组相比细胞穿透更多，宫颈癌的转移明显，加快创面愈合时间更短。侵袭性和转移率分别增加了1.86倍和2.07倍。这些结果表明，CDR1促进了宫颈癌的转移。

图4 CDR1促进子宫颈癌细胞转移

CDR1通过与IGF2BP1结合促进子宫颈癌细胞的EMT

作者将CDR1as过表达后，发现细胞呈梭形形态，而转染空载体的细胞表现出明显的边缘化；并且发现CDR1的增加，降低了E-cadherin的表达，而增加了间充质标记物 N-cadherin和波形蛋白的表达增加，其中Slug 上调最多。通过进一步生信分析，发现CDR1as与20个miRNA之间存在潜在结合。其中miR-203可以调节Slug的表达。然而，CDR1作为探针进行pull-down实验，并没有发现Slug通路相关的miRNA，说明Slug可能没有被miRNA海绵调控。作者对一些报告进行研究，发现CDR1能够影响蛋白质的相互作用。因此，进行RNA-pulldown分析后，发现在35kD~70kD之间存在几个单独的蛋白条带。生物信息检测到IGF2BPs与CDR1as相互作用，并在70 kD左右发现了印迹与IGF2bp的分子量吻合。然后进一步做了RIP和pull-down实验，发现IGF2BP 1/2/3可以与CDR1as结合。当CDR1作为探针只能检测到IGF2BP1，说明IGF2BP1可能是一个特异性潜在的下游靶点。IGF2BP1可以识别m⁶A在mRNA上的修饰位点，防止其衰变并维持其靶向mRNA的稳定性。作者在过表达CDR1的细胞中沉默了IGF2BP1，结果发现CDR1的降低可诱导Slug表达上调。 RIP实验表明，IGF2BP1优先与Slug mRNA上的m⁶A修饰位点结合。沉默IGF2BP1也能抑制CDR1，增加转移和侵袭能力。综上所述，CDR1与IGF2BP1特异性结合，以稳定和提高Slug的表达。

图5 CDR1通过与IGF2BP1结合促进子宫颈癌细胞的EMT

TGFβ信号可能通过子宫颈癌细胞中的CDR1as和m6A激活EMT

研究表明，N6-甲基腺苷参与RNA代谢的几乎所有步骤，这是转录修饰的重要组成部分。结合CDR1作为功能和机制的初步验证，作者分析了CDR1as上调后的不同mRNA水平和m⁶A水平。KEGG和GO分析表明，CDR1显著激活了TGF-β的信号。过表达的CDR1显著激活了p-smad2和p-smad3。当过表达的CDR1细胞被LY2109761处理时，这些EMT表型都逆转到载体水平，这表明CDR1通过激活TGF-β信号促进EMT。过表达的CDR1细胞的细胞穿透的数量明显增加。这些结果表明，CDR1激活TGF-β信号通路和EMT促进宫颈癌细胞的转移。

图6 CDR1as激活子宫颈癌细胞中的TGF-β信号通路，促进EMT

CDR1可促进体内子宫颈癌细胞的进展

作者接着在体内进行探索，研究发现原发肿瘤生长与对照组、CDR1组的生长存在差异。在裸鼠前鳍皮下注射时，肿瘤体积较对照组增加。当CDR1过表达时，肿瘤的团块更大，体重减少。小鼠足垫注射时，CDR1组出现腹股沟淋巴结明显肿胀。因此，CDR1可促进子宫颈癌细胞在体内的进展。

图7 过表达的CDR1as促进了宫颈癌在体内的进展

小结

大多数子宫颈癌的死亡可归因于转移，导致转移的机制尚未被完全渗透。作者对宫颈癌转移的相关机制进行研究。研究发现TGF-β的激活能促进CDR1的表达上调；CDR1as可以促进IGF2BP1对SLUG mRNA的调控，并稳定其不被降解；而沉默IGF2BP1会阻碍CDR1在宫颈癌中的相关转移。此外，也发现CDR1与淋巴结转移和生存时间缩短呈正相关，CDR1的过表达促进了宫颈癌的体内外转移。综上所述，CDR1as通过与IGF2BP1/SLUG mRNA作用激活TGF-β信号传导和EMT，促进宫颈癌转移，这也预示了治疗宫颈癌的潜在治疗靶标。