2023年第26届ASGCT于5月16日至20日在洛杉矶召开,汇聚了世界各地的基因和细胞治疗专业人士，是全球最大的专业从事基因和细胞治疗研究的非赢利性医学组织，也是世界基因与细胞治疗领域最具权威性与公信力的机构。我们整理了在2023 ASGCT中关于circRNA领域的最新研究进展，以飨读者。

  

01

利用四膜虫I型内含子和细胞内环状RNA的研究进行端到端自剪接，高效制备环状RNA

标题：Efficient Circular RNA Engineering by End-to-End Self-Targeting and Splicing Reaction Using Tetrahymena Group I Intron and Study of Circular RNAs in Cells

作者：Seong-Wook Lee（韩国龙仁檀国大学）

摘要编号：540

摘要：

环状RNA (circRNA)具有优于线性mRNA的优势，作为一种新的疫苗和治疗剂正获得成功。然而，新的circRNA制备方法几十年来一直没有开发出来。

在这项研究中，我们开发了一种新的体外环状RNA工程策略，利用四膜虫I型内含子核酶在体外转录过程中进行端到端自靶向和剪接(STS)反应，将没有任何外源片段的环状RNA提供给可能引发细胞中不必要的先天免疫反应的环状RNA序列。在高效自环化方面，做着对I组内含子核酶组分进行了优化，优化后的自环化RNA结构设计提高了自环化效率，可与内含子-外显子排列法(PIE)相比较。此外，还优化了上游工艺的体外转录条件和下游工艺的离子对反相高效液相色谱(IP-RP HPLC)纯化方法。使用CVB3 IRES的IP-RP hplc纯化的circRNA在HEK293A细胞中显示出与PIE法制备circRNA相似的高效蛋白表达。此外，在A549细胞中，没有外源片段和任何修饰的核苷酸circRNA诱导的先天性免疫反应可以忽略不计。总之，我们新的体外制备circRNA策略可有效地在体外产生circRNA，并用于细胞中的蛋白表达和各种应用。

  

02

circAde，一个依赖环状RNA生物发生的剪切体的和延长更有效的蛋白表达的载体系统

标题：circAde, a Vector System for Spliceosome Dependent circRNA Biogenesis and Prolonged More Effective Protein Expression

作者：Thomas B. Hansen（Karolinska Institutet）

摘要编号：1095

摘要：

环状RNA (circRNA)是一类新型的内源性表达RNA。与mRNA相比，环状RNA具有抵抗核外降解的能力，从而具有较高的细胞内稳定性和持久性。近年来，对体外内circRNA产生的理解都有了显著提高，现在可以设计circRNA进行高效的蛋白质翻译。因此，工程化环状RNA正在作为一种新的治疗概念出现，它可能克服mRNA面临的一些挑战。治疗性环状RNA的生产可以通过两种不同的机制实现，1)使用内含子I型衍生的核酶循环进行体外生产，或2)使用类似内源性环状RNA生物发生的基于剪接体的反剪接进行体内生产。在后一种设置中，插入侧翼倒置重复(IR)元件可以通过将剪接位点定位在接近空间的位置来显著刺激反向剪接。

在这里，我们展示了我们专有的circRNA表达系统circAde，允许通过剪接体依赖的生物发生高效circRNA生产。通过一组概念验证报告，我们发现某些设计特征极大地影响了circRNA的产生和随后的蛋白质表达，特别是IR和IRES(内部核糖体进入序列)元件的选择。研究人员查询了公开可用的RNA测序数据集，以鉴定多种细胞类型中最丰富的环状RNA侧翼的IR元件。候选IRs在我们的circAde系统中进行了测试，并对那些能够刺激最高水平circRNA产生的IRs进行了修饰，以进一步提高circRNA的产量。由于没有5’cap, circRNA依赖于IRESs进行有效翻译。令人惊讶的是，除了促进circRNA翻译外，我们观察到IRES的选择也影响了circRNA的生物发生和产量。通过对1000多个假设的IRES元件进行两个正交IRES筛选，我们已经确定了黑色素瘤和肺癌细胞系中最有效的IRES序列，能够高效进行的circRNA生产和高产蛋白表达。此外，通过比较circAde和基于mRNA的载体的蛋白质输出，我们发现circAde系统在转基因产量和表达的时间可持续性方面优于传统的基于mRNA的方法。此外，circAde系统在选择转基因有效载荷和载体主干时具有高度通用性。总之，我们的研究结果为开发新的、更有效的策略来治疗需要持久转基因表达的疾病的新平台提供了技术上的概念验证。

  

03

使用环状RNA引导物来纠正胶原蛋白VI相关萎缩症的显性抑制甘氨酸替代的热点问题

标题：Use of Circular RNA Guides to Correct a Hotspot of Dominant-Negative Glycine Substitutions Causing Collagen VI-Related Dystrophies 

作者：Carsten G.Bonnemann（NINDS/NIH ）

摘要编号：677

摘要：

胶原蛋白VI相关营养不良症（COL6-RD）是一组先天性神经肌肉疾病，目前尚无有效的治疗方法。显性抑制作用的致病变体，特别是保守的胶原蛋白Gly-X-Y动点的甘氨酸替换，在COL6A1、COL6A2和COL6A3基因的三螺旋结构域中很常见。由于它们在三螺旋结构域中的特殊位置，它们能够纳入胶原蛋白α1、α2和α3（VI）链的分级组装，从而产生功能失调的胶原VI细胞外基质。两个最常见的Gly替代，p.G284R和p.G293R位于α1（VI）链中，构成了一个显性抑制突变的热点区域。大多数甘氨酸错义致病变体是由单次鸟苷(G)到腺苷（A）的突变引起的，使其适用于使用内源性腺苷脱氨酶(ADARs)的RNA编辑方法。ADARs使用双链RNA作为底物来催化腺苷（A）到肌苷（I），这在翻译过程中模拟了G。

在这里，我们研究了使用环状ADAR募集RNA来招募内源性ADAR酶来改变特定的A到I，作为一种治疗G>A突变引起的胶原蛋白VI相关的营养不良症的方法。RNA环化改善了RNA的稳定性，增加了对细胞外切酶的抗性，从而提高了可编程RNA编辑的效率和持久性。值得注意的是，在HEK293T细胞中，携带p.G284R和p.G293R等位基因的荧光报告基因结果表明，使用单一的环状ADAR募集RNA来解决这两种变异体时，RNA编辑的百分比分别高达22%和25%。这种方法将在体内外患者来源的成纤维细胞和正在生成的人源化小鼠模型中进行测试。

  

04

环状RNA定位于人脑突触并在阿尔茨海默病中差异表达，暗示其在突触功能的关键作用，可能为基因治疗提供新的靶点

标题：Circular RNAs Localize to Synapses in the Human Brain and Differentially Expressed in Alzheimer’s Disease Implicating Critical Roles for Synaptic Function Which Could Present New Targets for Gene Therapy

作者：Paul N. Valdmanis（华盛顿大学）

摘要编号：1664

摘要：

环状RNA（circRNA）是一种独特的转录异构体，可能在人脑中发挥关键的调节作用，对神经退行性疾病如阿尔茨海默病（AD）的发展有影响。circRNA通过前体 mRNA 的外显子反向剪接而形成闭环结构。除了翻译功能之外，它们还可以发挥多种功能，包括作为microRNA和蛋白质的 “海绵 “来调控蛋白表达。circRNA因为耐受核酸外切酶，能稳定存在于细胞质中。AD是最常见的痴呆形式，其分子特征是由淀粉样β肽和过度磷酸化的tau蛋白的神经原纤维缠结组成的斑块逐渐积累，导致突触和神经元损失以及认知障碍。前人的研究表明，circRNA优先定位于突触，许多circRNA表达在AD中受到干扰。我们使用新技术和统计方法添加了新的见解，从而证实这一结论，并且在此基础上确定了已鉴定circRNA的功能作用。为了发现和量化AD肿突触定位的RNA转录本，我们采集了30多个死后人脑样本，包括AD患者和对照组。从均质化的脑组织中，我们用蔗糖梯度超速离心法对突触颗粒（突触体）进行分离。接下来，我们从突触体部分和匀浆中提取了RNA，然后通过捕获非典型的核糖去除总RNA的策略获得RNA测序数据。通过比较突触体和匀浆，我们证实绝大多数的circRNA在突触中富集。

此外，通过比较AD和对照组的突触体，我们发现还有许多circRNA差异定位在AD中的突触上，表明其作为基因治疗干预的潜在靶点有望改善疾病。在最显著的差异定位的circRNA中，基因GSK3B的两种亚型最为突出。其中，一个异构体是外显子7、8和9形成的环，另一个异构体是外显子9和10形成的环。最有趣的是，前者在AD中上调，而后者在AD中下调。由于GSK3B在tau过度磷酸化中具有明确的作用，因此我们发现AD中有两种独特的GSK3B环状亚型，它们在AD的突触处有不同的定位。为了研究每种亚型的影响，我们在SH-Sy5y细胞中转染了含有互补Alu元件的circGSK3B外显子质粒。我们发现转染这些质粒都会导致GSK3B蛋白及其磷酸化状态的蛋白质丰度差异，这可能与AD分子病理学有关。我们假设这些circRNA对包括tau蛋白的蛋白质表达有进一步的下游影，为通过传递或操纵circRNA来调节蛋白表达以治疗疾病提供了基础。circRNA在细胞质中的多功能作用和稳定性，具有巨大的应用前景。我们的工作进一步揭示这些发现的意义，并且对这类分子研究提供了新见解。

分类： circRNA与疾病, circRNA生物学, 前沿动态, 最新重要进展, 每周进展汇总, 研究热点跟踪评论

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