前言
自1976年circRNA分子在植物类病毒基因组中被发掘，经过漫长30多年的沉寂，终在2012年一鸣惊人，并在随后几年时间里迅速成为新一代明星分子。
十年间，随着科研大咖在Nature和Cell等顶级期刊上阐述circRNA的机制和功能，以及mRNA新冠疫苗获批，推动科学家积极探索新的技术方向和应用领域，circRNA的热度一再被推向高潮！本文将从circRNA的简介、发展进程、研究现状、circRNA体外制备及circRNA行业现状与趋势等多个方向，为大家提供实现circRNA产学研结合的思路。
一、circRNA简介
1、什么是circRNA
环状RNA（circRNA）一般在细胞内产生，无5′-端帽子和3′-端poly (A)尾巴，由共价键相连的环状单链RNA。因环状结构可保护其免于核酸酶的降解，具有高稳定性的特点。目前普遍认为，环状RNA的产生利用了真核细胞生成mRNA的剪接（splicing）机制，即利用同样的酶体系通过反向剪接（back-splicing）形成环状RNA（图1A）。也有研究发现，有些情况下可通过拉近某个外显子两端而促进环化，如内含子中含有的回文或近似回文的序列杂交，或RNA结合蛋白（RBP）结合在外显子两端的内含子上（图1B）。从进化的角度看，环状RNA的形成可看作是一些偶然发生的反向剪接，并逐渐产生了可以主动产生新的反向剪接机制。
图1 反向剪接环化（A）和通过拉近外显子末端促进反向剪接（B）示意图
2、circRNA的生物学功能
作为一类结构特殊的RNA分子，circRNA在生命活动中的分子细胞生物学机制是一个令人着迷的问题。已发现的人类circRNA的总数量已达惊人的十万多种，不太可能仅用一两个简单的模型可以概括其功能。
circRNA生物学功能及应用主要囊括8个方面：RNA配体、miRNA海绵、蛋白质海绵、反义环状分子、先天免疫激活因子、先天免疫抑制因子、蛋白质翻译和生物标志物（如图2）。
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在特殊结构与多重生物学功能的加持下和近几年新冠疫情的影响下，circRNA作为RNA适体、基因表达平台、临床靶点和生物标记物等生物医学研究方向上的应用效果令人称赞。circRNA也逐渐成为非编码RNA领域的研究热点。
图2 circRNA的生物学功能及应用
二、circRNA发展进程
1、circRNA研究大事件
1976年
Sanger等人首次在电子显微镜下观测到植物细胞质中存在circRNA分子；
1993年
在小鼠中发现其Sry基因存在环状转录；
2012年
斯坦福大学Julia Salzman教授发现人体内大量存在circRNA；同期伴随着高通量测序技术的广泛应用，学者对circRNA的研究逐渐兴起；
2013年
Nature杂志同一期刊登两篇circRNA研究文章，自此circRNA迅速成为新一代明星分子；
2014年
张弓教授使用翻译组测序技术来辅助蛋白质组的鉴定，用于找到已知和未知编码基因的翻译证据，被人类蛋白质组织（HUPO）列为当年人类蛋白质组计划的首要突出贡献；
2015年
诸多研究学者解析了免疫应答因子、RBP、QKI和ALU原件等多种信号调控circRNA生成机制；黄胜林教授首次报道发现外泌体中存在circRNA；
2016年
circRNA的研究主要在形成机制、分子功能研究、疾病或生理活动相关性研究、研究工具和技术方法更新等方向。如，陈玲玲和杨力教授揭示了circRNA形成过程的动力学变化过程；李岩教授开发了首个汇总可编码蛋白的circRNA的数据库：circRNADb等；
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2017年
circRNA的研究主要在翻译功能。如，王泽峰团队首次发现大量的circRNA富含m6A修饰，可以像IRES一样驱动circRNA翻译；张弩团队发现circ-FBXW7可以翻译一种抑制胶质瘤的全新蛋白质；
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2018年
circRNA的研究主要体现在出核机制、内含子来源的circRNA定位胞质、反式拼接产物与circRNA的关系、病毒circDNA基因组表达circRNA产物、环状RNA（Cia-cGAS）参与造血干细胞静息状态调控等等；
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2019年
circRNA的研究热点主要在功能研究和机制探索。主要包括：circRNA生成、特殊类型circRNA的发现、m6A修饰、翻译、分子互作等，表明circRNA的功能研究已进入全新的阶段；
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2020年
circRNA研究出现了一些新技术方法和生信工具，有助于更高效的开展circRNA研究，包括：circRNA敲低/敲除技术、circRNA检测、相关的数据库与生信工具（circAtlas、VirusCircBase、TransCirc等）；
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2021年
circRNA的研究热点主要是miRNA sponge、circRNA结合蛋白、circRNA翻译、临床转化、免疫与修饰。circRNA作为“mRNA 2.0”，在基因治疗和新药开发的产业化道路上取得了重要的进展。在全球新冠疫情的环境下，mRNA疫苗的开发在全球掀起了一股技术创新的浪潮。
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2022年
在新冠疫情和肿瘤等疾病的背景下，circRNA替代mRNA的基因疗法与临床转化备受关注！魏文胜教授在Cell杂志期刊阐述了circRNA用于开发抵抗新冠病毒的疫苗的研究，环状RNA技术在新冠疫苗方面的应用转化，为未来一系列疾病领域的应用提供了可能。
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2023年
陈玲玲教授系统地对环状RNA命名进行了梳理和总结，提出了环状RNA规范命名原则，并呼吁领域同行专家共同努力，推动环状RNA命名规范化进程，促进环状RNA研究交流和发展。
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2023年，circRNA仍在继续！
自此circRNA的征途便是星辰大海，逐渐被誉为“mRNA的2.0”！
2、circRNA融资大事件
2021年迎来环状RNA相关企业的融资元年，国内外企业得到了大规模的资金注入，大力推进了环状RNA领域的产业化进程。circRNA成为新风口，引起各方抢滩布局！
2021年2月
作为全球首家利用环状RNA技术开发新疗法的公司，美国Orna Therapeutics宣布其“环状RNA疗法”项目首获8000万美元融资。
2021年5月
Laronde以5000万美元资金创立，并在3个月后，该公司再获B轮4.4亿美元融资。
2021年6月
国内圆因生物完成天使轮数千万美元融资，同年12月，宣布完成超2000万美元Pre-A轮融资。成为国内首家使用环状RNA技术开发新冠疫苗的团队。
2021年12月
美国Circular Genomics公司表示筹集了450万美元的种子资金，旨在将环状RNA生物标志物技术的抑郁症测试商业化，该公司指出环状RNA在脑部疾病中的临床转化拥有可喜的研究前景。
2022年8月
美国Orna Therapeutics宣布完成2.21亿美元B轮融资，其中默沙东（MSD）投资1亿美元。此轮融资将用于推进其原位CAR-T疗法isCAR走向临床，以及其他内部和合作临床前项目的开发。
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2023年4月
Orbital公司获2.7亿美元A轮融资，Orbital将LNP和VLP以及环状RNA 结合在一起，构建首个RNA技术、递送方法、数据科学和自动化交叉的技术平台。其中环状RNA技术授权自斯坦福大学张元豪（Howard Chang）教授。
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2023年5月
ReNAgade Therapeutics宣布获得3亿美元的A轮融资。他与Orna成立了一家合资企业，将ReNAgade的递送平台与Orna的环状RNA技术相结合，以发现和开发支持此前Orna与默克公司达成的重大合作项目。
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环状RNA已然成为资本的新宠，正在迎来发展的黄金期，让我们拭目以待！
三、circRNA研究现状
1、circRNA研究概况
近十年来，环状RNA研究几乎从零开始，但发展迅猛。特别是自2020年新冠疫情以来，生物产业领域认识到环状RNA既可作为药物新靶点或疾病诊断的标志物，又可以人工合成环状RNA导入体内用作疫苗或治疗癌症等疾病的核酸药物。2020—2022年，每年有2000篇左右的研究论文以环状RNA为主题，另外还有100篇以上的综述发表。2021年在全球开启了环状RNA研发和产业化的投资热潮。可以预见，环状RNA的分析、制备和应用必将成为生物经济的未来关键技术。
2、circRNA研究方向
有以下几个主要研究方向：
①在体内的分布及含量分析，如细胞内、组织、体液及细胞间经外泌体的交换等；
②内在功能及机制，如直接吸附其他分子或通过翻译发挥作用、如何影响癌症等；
③人工制备及导入，如体外和体内制备技术（涉及克级以上的较大规模生产），既包括体内本来存在的，也包括人工新设计的序列；
④各种涉及以上研究的生物技术在环状RNA领域的应用，如提取、荧光标记、定量分析、酶工程、测序技术及组学分析等。
3、circRNA科研文章产出
近年来，随着circRNA功能、作用被逐步揭开，科学家们开启了环状RNA研究热潮的大门，围绕circRNA的研究工作越来越受到重视，甚至是热捧，相关文章也越来越多。
2022年，circRNA基础研究又上新台阶，在PubMed网站使用[Title/Abstract]限定范围检索“circRNA”或“circular RNA”，可检索相关文章共2575篇。有1200余篇影响因子大于5.0，其中270篇大于10.0，表明环状RNA基础研究水平快速提高（统计方法存在一定的局限性，数据仅供参考）。整体来看，circRNA基础研究在5-10和10以上的文章数较2021年均有近乎翻倍的增长，实现了在“质”和“量”上的大幅提升。（图3列举了2017-2022年间每一年在不同影响因子范围内所发表的文章数目）
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图3 circRNA研究论文数目统计
4、环状RNA应用范围
环状RNA具有非常广阔的应用前景。越来越多的研究发现，环状RNA与感染性疾病、罕见病、血液病、自身免疫病、肿瘤等多种疾病相关（表1）。
表1 部分与疾病相关的环状RNA情况表
四、circRNA体外制备
1、circRNA体外制备的背景
circRNA最初由于其自身的特性受到科研学者的青睐。随着mRNA新冠疫苗的成功研制和使用，进一步凸显出了RNA疗法在疫苗制备和药物研发领域的优势。但mRNA的局限性也很明显，如：mRNA疗法需要产生高水平浓度的蛋白；mRNA疗法产生蛋白的组织生物可利用度差、血循环中的半衰期短以及载体的靶向递送效率低；重复给药会激发先天免疫反应。
circRNA的出现近乎完美地避开了mRNA的缺陷，也被大家称为mRNA技术2.0版，在生产、递送和治疗方面更具优势。且目前海外巨头已在mRNA领域布下了强大的专利壁垒，是众多国内后来者难以绕开的挑战；而circRNA作为下一代RNA技术，正在另辟蹊径，得到了业界的关注，必将开拓千亿蓝海市场。
无疑，RNA环化技术是该行业的核心技术之一，各个公司采取了不同的方法。如Orna Therapeutics基于核酶（PIE技术）oRNA平台，圆因生物为Ana PIE平台，环码生物采用II型内含子自剪接系统，科锐迈德（CureMed）使用I型内含子自剪接系统的Clean-PIE，吉赛生物采用无需夹板的T4Rnl2成环策略circPureTM和无序列残留精准制备PIE系统circPreciseTM（已有环状RNA产品投入市场）等。
2、circRNA人工制备的方法
过去，通常有三类circRNA人工制备方法，包括Ⅰ型内含子自剪切、Ⅱ型内含子自剪切和T4 连接酶的方法。随着科学研究的不断深入和合成工艺的持续革新，在已有环化策略的基础上做出了新的创新以解决传统方式无法满足的制备需求。
（1）Ⅰ型内含子自剪切
此前，Ⅰ型内含子自剪切的方式已被广泛用于体外环化短的RNA序列，58至124 nt的环化效率高达80%以上，但是对于长序列（1500nt以上）的环化效率无法达到量产要求[1]。Y Grace Chen和Wesselhoeft等人对于此种方法做出了优化，可在体外有效环化长度1500nt以上的RNA。
图4 I型内含子自剪切系统框架设计
（2）Ⅱ型内含子自剪切
Ⅱ型内含子自剪切有2种形式：利用酵母菌Ⅱ型内含子和破伤风杆菌Ⅱ型内含子的自催化剪接反应在体外人工制备circRNA。这种方式，没有大片段的外源残留，但制备效率低，目前很难进行工业化制备[2]。
图5 酵母II型（左）和破伤风杆菌II型（右）内含子自剪切制备circRNA
（3）T4连接酶法
传统方法用T4 DNA或T4 RNA连接酶借助夹板序列可以实现体外circRNA制备，但此过程环化效率很低，副产物很多，纯化工艺复杂，很难实现工业化制备[3]。
图6 T4连接酶法利用夹板链或辅助链制备circRNA
（4）新型circRNA制备核心专利策略：
策略一：circPureTM
针对传统T4连接酶法（夹板法）做出优化，根据要合成的线性RNA序列的二级结构，通过AI模拟序列最佳环化位点，以设计好的线性RNA为原料，通过酶促反应实现RNA自我环化，达到高效环化目的序列的效果。其特点在于：
-
采用AI模拟成环；
-
无需夹板链或辅助链，利用RNA自身的二级结构高效成环；
-
工艺稳定，环化效率可达90%以上；
-
无大片段残留、降低副产物生成和纯化工艺简单。
策略二：circPreciseTM
在Ⅰ型内含子自剪切方法的基础上，根据要合成的线性RNA序列的二级结构，通过AI模拟序列最佳环化位点，利用鱼腥藻内含子自剪切系统，在不插入外显子序列的情况下人工制备circRNA。其特点在于：
-
采用AI模拟成环；
-
无需引入外显子序列；
-
环化效率在90%以上；
-
可实现精准制备，复刻天然的circRNA。
五、circRNA行业现状与趋势
1、环状RNA的行业现状
目前已有多家企业布局环状RNA产业（包括Orna Therapeutics、Laronde、吉赛生物、环码生物、圆因生物、科锐迈德等），且有越来越多的企业正在加入环状RNA赛道（表2）。大部分公司以开发环状RNA药物及疫苗为主，另有部分公司定位于环状RNA相关疾病的诊断或开展环状RNA相关的科研服务。而从全球视角看，目前国内外在此领域都尚处于早期阶段，在同一起跑线上。对于国内企业而言这是难得的引领国际环状RNA产业发展的机会。相信在环状RNA赛道上，我国能显示出强大的国际竞争力。
表2 企业环状RNA管理开发和业务板块
注：根据公开资料整理
2、环状RNA的产业发展
2021年，国内外环状RNA疗法企业成立并开始布局管线开发。2022年，各家研究机构和企业相继发布最新成果和进展。
2022年3月
圆因生物首次报道其环状RNA疫苗技术平台，以及据此开发的针对新冠病毒及其一系列变异株的环状RNA疫苗。宣称该项研究中制备的针对新冠病毒德尔塔变异株的环状RNA疫苗（circRNARBD-Delta）对多种新冠病毒变异株具有广谱保护力。
2022年4月
吉赛生物推出两项原创专利环化技术circPure™和circPrecise™。区别于传统的T4连接酶和内含子自剪接策略，吉赛生物规模化体外制备环状RNA的效率可达90%，产物纯度可达99%，可为全球客户提供包括药物开发、序列设计、circRNA生产、circRNA-LNP包封、药效评估等创新疗法CRO服务。
2022年5月
环码生物发布了其最新开发的基于II 型内含子的RNA环化技术。该技术制备效率高且无需添加蛋白酶、GTP等辅料，且其终产物中不残留任何多余序列。
2022年6月
科锐迈德公开了其高效、精准、低免疫原性的环状mRNA底层成环框架技术，称为“Clean-PIE”，实现了量产放大和体内长时间持续的表达。
2022年6月
第十四届中国生物产业大会暨第六届环状RNA研究与转化论坛（广州市生物产业联盟和吉赛生物联合主办）召开，来自全球产、学、研、医等领域的行业领军人物在广州集结。环状RNA研究与转化论坛已成功举办六届，大大促进了我国在环状RNA领域的融合发展。
2022年8月
美国默沙东（MSD）公司宣布与美国Orna Therapeutics公司达成一项总额高达36.5亿美元的合作协议，已开发和商业化多个项目，包括传染病和肿瘤学领域的疫苗和疗法。
2022年10月
合成生物学公司Ginkgo Bioworks宣布收购拥有专有环状RNA和启动子筛选平台的Circularis公司。Circularis平台拥有快速识别具有适当强度和组织特异性的新型启动子的能力，可快速识别肿瘤微环境中的特殊启动子，也可与基因治疗中的有效载荷和衣壳结合，助力Ginkgo的生物生产、RNA治疗、细胞治疗和基因治疗方面的解决方案。
2022年11月
浙江大学智能创新药物研究院、中国计量大学-奥明生物联合实验室研究团队开发了DeepCIP工具，该工具采用了多模式深度学习方法专门对环状RNA IRES进行预测，能更好地帮助研究环状RNA的编码潜力及提升环状RNA药物的设计能力。
2023年1月
上海先博生物宣布与Orna达成合作，联手推进下一代环状RNA技术的应用。
由先博生物负责对Orna公司利用突破性环状mRNA技术（oRNA）开发的体内细胞治疗产品在大中华区抗肿瘤领域的开发和上市，其中包括Orna公司管线中最领先的抗CD19 原位嵌合抗原受体T细胞技术 (isCAR) 项目，名为“ ORN-101”。
详细介绍可参考circRNA精彩推文：
2023年1月
创新型口服mRNA开发商Esperovax与合成生物学巨头Ginkgo Bioworks合作开发治疗结肠癌的环状RNA疗法，Ginkgo将对大量基于Esperovax的细胞类型特异性环化机制设计的RNA进行设计、构建和筛选。
详细介绍可参考circRNA精彩推文：
2023年5月
斯微生物与百度等单位跨界在Nature发表重磅文章：AI算法赋能mRNA序列设计，人工智能加速circRNA药物开发。实验验证充分表明了LinearDesign算法在编码不同蛋白的mRNA序列设计上的适用性，斯微生物表示开发新型环状RNA序列设计算法以及肿瘤新抗原预测人工智能算法，加速mRNA疫苗和药物的开发。
国内外企业持续深化环状RNA布局，加速释放了下一代RNA疗法的潜力。我们期待着，通过产业布局的“大手笔”频出，为未来生物医学注入不竭动力。
详细介绍可参考circRNA精彩推文：
结语
核酸药物开启了继小分子药物、抗体药物之后的第三波药物革命新浪潮，circRNA技术作为下一代RNA疗法在mRNA疫苗产业的带动下蓄势待发。内源的环状RNA可作为药物新靶点或疾病诊断的标志物，而人工制备的环状RNA可针对多种靶点并在细胞内发挥作用。显然，环状RNA必将成为全球生物经济的未来关键技术。诸多circRNA疗法新锐企业，在新冠疫苗、CAR-T、蛋白替代疗法等领域均有突破性进展。circRNA体外制备是未来科研、临床及产业化发展进步的重要前提。对于国内外的企业而言，大家都在不惜成本地布局专利技术，研发如何更好地制备circRNA，天下已成大争之势！对于科研研究者而言，大家期待这一创新技术能够在未来的疾病预防和治疗中大显身手，实现产学研的共赢！
参考文献：
[1].Puttaraju, M., and Been, M.D. (1992). Group I permuted intron-exon (PIE) sequences self-splice to produce circular exons. Nucleic Acids Res. 20, 5357–5364
[2].Chen, Y.G., Kim, M.V., Chen, X., Batista, P.J., Aoyama, S., Wilusz, J.E., Iwasaki, A., and Chang, H.Y. (2017). Sensing Self and Foreign Circular RNAs by Intron Identity. Mol. Cell 67, 228–238.e5.
[3].Rausch, J. W., Heinz, W. F., Payea, M. J., Sherpa, C., Gorospe, M., and Le Grice, S. F. J. (2021). Characterizing and Circumventing Sequence Restrictions for Synthesis of Circular RNA In Vitro. Nucleic Acids Res. 49, E35.
